Research on cardiac differentiation from human embryonic stem cellshow to get beating cells in a dish

Resum

¿Research on cardiac differentiation from human pluripotent stem cells: how to get beating cells in a dish¿ El fallo cardiaco es una de las causas de muerte más frecuentes en nuestra sociedad. Desafortunadamente y a diferencia de otros animales, los mamíferos adultos carecemos de capacidades de auto-curación y regeneración en el corazón. Las terapias posibles a día de hoy están limitadas al tratamiento con fármacos que reducen la hipertensión, el implante de dispositivos de asistencia por intervención quirúrgica o el trasplante en los casos mas severos. La falta de donantes, la corta vida de los dispositivos, o ineficacia de los tratamientos farmacológicos han promovido que laboratorios de todo el mundo centren su investigación en posibles terapias celulares con el fin de reparar y regenerar el corazón dañado. En esta Tesis, con el objetivo de generar nuevas plataformas para la generación de células cardiacas funcionales en el laboratorio que sean aptas para el trasplante en un futuro, hemos explorado la posibilidad de manipular tanto el destino como la plasticidad celular usando diferentes tecnologías punteras como son : la reprogramación celular y la ingeniería genética. En primer lugar, aprovechando el descubrimiento de la reprogramación celular por la que el Dr. Yamanaka y el Dr. Gurdon recibieron el Premio novel en 2012 (1¿4), hemos generado células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSCs) a partir de células mesenquimales derivadas de sangre de cordón umbilical (ucMSCs), una fuente fácilmente accesible en el entorno clínico con una ventaja, la reducida probabilidad de rechazo en un futuro trasplante por la falta de complejo de histocompatibilidad II (5). De un modo sencillo, hemos reprogramado estas células con los cuatro factores de reprogramación celular descritos (OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC)2. Es importante destacar que también hemos reprogramado el mismo tipo celular con tan solo dos factores de pluripotencia (OCT4 y SOX2). Estas células mantienen su potencial de diferenciarse a células de los tres linajes embrionarios incluido el mesodermo cardíaco y a cardiomiocitos bajo condiciones de cultivo específicas. En segundo lugar, con el objetivo de acortar y abaratar el proceso de producción de cardiomiocitos in vitro, hemos diseñado un protocolo de conversión cardiaca, en el que a partir de fibroblastos dérmicos humanos, conseguimos células que expresan marcadores relacionados con tejido cardiaco. El protocolo induce en una primera fase, la des-diferenciación de los fibroblastos mediante la sobreexpresión de los dos factores de pluripotencia OCT4 y SOX2. Estos factores promueven en la célula, un estado de plasticidad o reprogramación parcial (6) haciendo posible que, bajo condiciones de cultivo específicas, y con la transducción del factor de transcripción meso-cardiaco GATA4, las células se diferencien a células con un fenotipo parecido al cardiaco. Finalmente, con el objetivo de definir nuevas condiciones y afinar los protocolos mencionados y para la generación de poblaciones puras de cardiomiocitos funcionales a partir de células madre pluripotentes o células somáticas, hemos ingeniado una línea de células madre humana reportera para el gen cardiaco que codifica para la cadena pesada de la Miosina (alpha myosin heavy chain o MYH6). Esta miosina, proteína fundamental para la formación del sarcómero o unidad contráctil, se expresa de manera temprana durante el desarrollo cardiaco y se mantiene a lo largo de la diferenciación y maduración de los cardiomiocitos (7). Mediante las técnicas de edición génica de sitio específico TALEN (8,9) y CRISPR/Cas9 (10,11) se han introducido los genes de fluorescencia (mCherry) y de resistencia a antibiótico (NeoR) directamente en el genoma de la línea de células madre embrionarias humanas ES[4]. Los genes introducidos mediante knock in actúan como reporteros de la expresión de MYH6 al estar regulados por el mismo promotor. Gracias a esta herramienta, hemos podido explorar diferentes condiciones de cultivo(12) para promover la diferenciación cardiaca a partir de células madre pluripotentes. La línea reportera para MYH6 nos permitirá descifrar mecanismos epigenéticos y celulares responsables de la diferenciación cardiaca en humanos, así como claves para la conversión directa de células somáticas a cardiomiocitos. El trabajo expuesto en esta Tesis muestra diferentes estrategias diseñadas con la intención de generar células cardiacas en el laboratorio con cierto impacto en la Medicina Regenerativa, ya que pueden definir nuevas perspectivas para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares humanas en el futuro. REFERENCIAS: 1. GURDON JB, ELSDALE TR FM. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 1958;182(4627):64-65. 2. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 2006;126:663-676. doi:10.1016/j.cell.2006.07.024. 3. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131:861-872. doi:10.1016/j.cell.2007.11.019. 4. Gurdon JB, Melton DA. Nuclear reprogramming in cells. Science. 2008;322(5909):1811-1815. doi:10.1126/science.1160810. 5. Kocaefe Ç, Balci D, Hayta BB, Can A. Reprogramming of Human Umbilical Cord Stromal Mesenchymal Stem Cells for Myogenic Differentiation and Muscle Repair. Stem Cell Rev Reports. 2010;6(4):512-522. doi:10.1007/s12015-010-9177-7. 6. Kurian L, Sancho-Martinez I, Nivet E, et al. Conversion of human fibroblasts to angioblast-like progenitor cells. Nat Methods. 2013;10(1):77-83. doi:10.1038/nmeth.2255. 7. Burridge PW, Anderson D, Priddle H, et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 2007;25(4):929-938. doi:10.1634/stemcells.2006-0598. 8. Sanjana NE, Cong L, Zhou Y, Cunniff MM, Feng G, Zhang F. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat Protoc. 2012;7(1):171-192. doi:10.1038/nprot.2011.431. 9. Christian M, Cermak T, Doyle EL, et al. Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases. Genetics. 2010;186(2):757-761. doi:10.1534/genetics.110.120717. 10. Garneau JE, Dupuis M-È, Villion M, et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 2010;468(7320):67-71. doi:10.1038/nature09523. 11. Mali P, Esvelt KM, Church GM. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 2013;10(10):957-963. doi:10.1038/nmeth.2649. 12. Lian X, Hsiao C, Wilson G, et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc ¿. 2012;109(27):E1848-E1857. doi:10.1073/pnas.1200250109.