Caracterización de lipi-2, una nueva isla de patogenicidad de "Listeria"

Resumo

El género Listerina contiene dos especies patógenas L. Monocytogenes y L. Ivanovii. A diferencia de L. Monocytogenes, L. Ivanovii presenta, junto a otras características patogéncias difereciales, un marcado tropismo e hospedador hacia los rumiantes. En este trabajo de tesis, partiendo de unos mutantes espontáneos de L. Ivanovvi afectados en la producción de dos factores de virulencia (una esfingomielinasa y una internalina secretada), hemos identificado y caracterizado una nueva isla de patogenicidad (PAI) de Listeria. Se trata de de LIPI-2, una región cromosómica específica de L.ivanovvi, que comprende el gen de la esfingomielinasa (smcL), diez miembros de la familia multigéncia de las internalinas y una ORF de función desconocida. LIPI-2 cumple la mayoría de los criterios que definen habitualmente a las PALs: (i) gran tamaño (22 kb), (ii) presencia exclusiva en una especie que representa una patovariedad dentro del género Listeria, composición de DNA significativamente distinta a la del resto del genoma. (iii) punto de inserción asociado con un locus tRNA (iv) inestabilidad genética. LIPI-2 es la primera PAI identificada en bacterias gram-positivas para la que se demuestra inestabilidad genética y asociación con un locus tRNA, una estructura normalmente utilizada como punto de inserción de elementos genéticos móviles tales como fagos o plásmidos integrativos. El locus donde se encuentra el gen tRNA afectado por LIPI-2, enmarcado por los loci ysnB e ydel, no alberga más que una ORF enL. Monocytogenes EGDe. El análisis de la secuencia de dicha región intefénica en otras cepas y especies del género sugiere que dicho locus constituye un "punto caliente" de variabilidad genética que permite la inserción de distitnos fragmentos de DNA. La inestabilidad genética de LIPI-2 se manifiesta dando lugar a una deleción específica y reproducible que afecta a una porción de la isala así como a un fragmento de la región cromosómica adyacente. La deleción va acompañada de una pérdida de virulencia en el modelo murino y en el hospedador natural de L. Ivanovii, la oveja.En este animal, la deleción de LIPI-2 está aparentemente asociada a un cambio en el tropismo tisular. De las diez internalinas codificadas en LIPI-2 está aparentemente asociada a un cambio en el ropisimo tisular. De las diez internalinas codificadas en LIPI-2, ocho son del subgrupo S-Inl, caracerizado por su pequeño tamaño, su estricta dependencia expresional de PrfA y su crácter soluble. Las otras dos internalinas pertenecen al subgrupo L-Inl, de mayor tamaño, con dominios de anclaje a la pard bacteriana, de expresión independiente d ePrfA (o sólo paracilamente controlada), y abundantes en L. Monocytogenes. Estas dos internalinas constituyen los primeros representantes de esta clase identificadas en L. Ivanovii. LIPI-2 está presente con la misma estructura genética en todas las cepas de L. Ivanovii analizadas lo que refleja sin duda la importancia de este locus cromosómico para la biología de L. Ivanovii. Esta PAI está también insertada, en el mismo locus cromosómico, en la subespecie londoniensis, indicando que fue adquirida en un momento lejano en el tiempo, antes de la diversificación de L. Ivanovvi en las dos subramas evolutivas que la componen. La adquisición y posterior evolución de LIPI-2 ha jugado probablemente un importante papel en la definición de la especie L. Ivanovii así como en el desarrollo de su especificidad patogénica. Junto a los mutantes espontáneos de deleción de LIPI-2, hemos identificado en este trabajo otros tres mutantes estables de fenotipo débilmente hemolítico. Dos de ellos presentan defectos genéticos en el gen prfA, que codifica el regulador central de la virulencia de Listeria (prfA). Uno de los mutantes resulta de la deleción en fase de un fragmento central del gen prfA, dando lugar a una proteína funcional por pérdida del dominio de unión al DNA. El otro mutante presenta una mutación puntual que rompe la fase de lectura, dando lugar a una proteína PrfA truncada que mantiene cierta actividad residual. El análisis de este mutante revela la importancia del dominio C-terminal de cremalleras de leucina en la función transcripcional de PrfA. El tercer mutante obedece a un defecto genético desconocido, presumiblemente afectando a un locus que controla la expresión de al menos smcL y la internalina i-inlE.Todas estas mutaciones fueron obtenidas sometiendo a L. Ivanovii a condiciones de estrés asociadas conestancias prolongadas a elevada temperatura y/o fase estacionaria, reflejando el carácter dispensable de los genes de virulencia cuando la bacteria crece in vitro en el laboratorio