Efecto protector de los isotiocianatos y órgano-sulfurados solos o en combinación con la vitamina C frente al daño al dna inducido por la n-nitrosopiperidina y la n-nitrosodibutilaminamecanismos de acción

Abstract

El objetivo principal del presente trabajo de investigación consistió en evaluar el ¿Efecto protector de los compuestos isotiocianatos (ITCs) y de los organosulfurados (OSCs) solos o en combinación con la vitamina C frente al daño al DNA inducido por la N-nitrosopiperidina (NPIP) y la N-nitrosodibutilamina (NDBA), presentes en los alimentos. Así como, en determinar los posibles mecanismos de acción por los que estos compuestos ejercen su efecto protector¿. Para ello, se utilizó la línea celular de hepatoma humano (HepG2) y la electroforesis alcalina de células individuales o ensayo Cometa, con una modificación, que consistió en utilizar las enzimas formamidopirimidina-DNA-glicosilasa (Fpg), endonucleasa III (Endo III) y 3-metiladenina-DNA g licosilasa (AlKa). Las dos primeras enzimas reconocen las purinas y las pirimidinas oxidadas, respectivamente, y la última enzima las purinas alquiladas. En la fase inicial de este trabajo, evaluamos el daño al DNA inducido por la NPIP y la NDBA. Nin guna de las N-nitrosaminas evaluadas indujeron una ruptura significativa de las cadenas del DNA, mientras que cuando las células HepG2 se incubaron conjuntamente con las enzimas Fpg, Endo III y AlKa y las N-nitrosaminas, se observó un incremento elevado del daño oxidativo y alquilativo al DNA. Como era de esperar, ambas N-nitrosaminas indujeron un daño alquilativo al DNA mayor que el daño oxidativo. Además, la NPIP requirió concentraciones más elevadas que la NDBA para ejercer su efecto genotóxi co. Posteriormente, determinamos si la NPIP y la NDBA inducían apoptosis en dos líneas tumorales humanas: células de leucemia (HL-60) y de hepatoma (HepG2), utilizando diferentes técnicas como la microscopía de fluorescencia, la citometría de flujo ( ensayo Anexina V/IP y TUNEL) y el Western Blot [ruptura de la poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP)]. Las dos N-nitrosaminas redujeron la viabilidad de las células HL-60 y HepG2 mediante la inducción de apoptosis. La línea celular HL-60 mostró una mayor sensibilidad a la inducción de apoptosis por la NPIP y la NDBA, presentando esta última N-nitrosamina un mayor efecto apoptótico. Además, la apoptosis inducida por la NPIP y la NDBA fue dependiente de la activación de las caspasas en ambas líneas cel ulares, actuando indistintamente las caspasas-8 y -9 como caspasas iniciadoras en las células HepG2. Por último, se utilizó el diacetato de 2¿,7¿-diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA) para detectar la producción intracelular de las especies reactivas...