Nuevas funciones celulares de GRKs implicaciones físico patológicas

Resumen

En los últimos años, se están descubriendo un número creciente de funciones celulares adicionales para las quinasas de receptores acoplados a proteínas G (GRKs), inicialmente conocidas por su participación en la desensibilización de estos receptores. En este trabajo, aportamos nuevos datos sobre interacciones funcionales entre GRKs y MAPKs. En primer lugar, describimos que GRK5 es capaz de regular funciones celulares dependientes de la subunidad ¿12/13 de las proteínas G heterotriméricas, a través de su interacción con esta proteína preferentemente en su estado no activo. La fosforilación de GRK5 en S114, por ERK MAPK u otras quinasas, parece aumentar la afi nidad de GRK5 por la forma activa de G¿12. Por otro lado, al inicio de esta tesis nuestro grupo describió que GRK2 fosforila a la MAPK p38, inhibiendo su activación y actividad. En el presente trabajo, detectamos cambios en la fosforilación inhibitoria de p38 por GRK2 en procesos como la diferenciación de células adipocíticas y en la secreción de citoquinas infl amatorias por macrófagos en respuesta a LPS. Hemos generado nuevos fosfoanticuerpos para mejorar la detección de esta fosforilación y explorar otros procesos en los que podría estar implicada. En general, no hemos hallado correspondencia entre los niveles de GRK2 o estímulos que activan esta quinasa y la señal detectada por los fosfo-anticuerpos anti-pT123-p38, indicando que este proceso debe de ser muy dinámico, muy específi co de contexto celular o modulado por factores adicionales. Sin embargo, sí hemos detectado diferencias en el nivel de pT123-p38 en cardiomiocitos estimulados con isoproterenol, así como en determinados tipos celulares en situación ¿basal¿, aunque nos queda por defi nir el signifi cado biológico de estas diferencias. Por último, hemos descrito que GRK2 interacciona directamente y en células con MEK, y que esta asociación es más estable cuando MEK está activa. El efecto inhibidor de GRK2 sobre ERK es principalmente independiente de la actividad quinasa de GRK2 en varios tipos celulares tales como células epiteliales, esplenocitos y astrocitos. Sin embargo, GRK2 no altera signifi cativamente la fosforilación de ERK por MEK in vitro. Estos resultados, junto con otros descritos en esta memoria, parecen indicar que GRK2 puede estar secuestrando a MEK en determinadas localizaciones subcelulares. Por otro lado, hemos analizado el efecto de la reducción crónica a nivel sistémico de los niveles de la proteína GRK2 en la patofi siología cardíaca, utilizando como modelo ratones hemicigotos GRK2+/-. La disminución en los niveles de GRK2 induce el desarrollo de una hipertrofi a cardiaca temprana con la edad, que parece ser de tipo compensado y no patológico, dado que no existe presencia de fi brosis o disfunción cardiaca aparente según un estudio ecocardiográfi co. Además, detectamos a los 9 meses una reprogramación de la expresión génica en ratones GRK2+/-, con una reducción en la expresión de genes fetales indicativos de remodelado patológico, así como un aumento en la expresión de marcadores de funcionalidad cardiaca, de tipo cardioprotector. La vía de señalización cardioprotectora de MEK-ERK se encuentra sobre-activada a nivel basal en ratones hemicigotos para GRK2 a los 9 meses. Además, los ratones GRK2+/- muestran hipersensibilidad a insulina con un mayor incremento en la fosforilación de componentes de esta ruta a diferentes niveles en corazón en respuesta a un tratamiento agudo con esta hormona. Por el contrario, los niveles de GRK2 están aumentados en muestras de pacientes con síndrome metabólico. Estos datos apoyan la existencia de una inhibición de la vía de insulina por GRK2 a distintos niveles. Puesto que la vía de insulina media crecimiento tisular y es cardioprotectora, y dado que GRK2 inhibe la ruta de ERK tanto a nivel basal como inducida por insulina, el conjunto de nuestros datos puede explicar que en animales con menores niveles de GRK2 la hiperactivación de estas rutas promueva el desarrollo de hipertrofi a cardiaca y que ésta sea de tipo compensado. Resumen/Summary An increasing number of cellular functions have been proposed in the last few years for G protein-coupled receptor kinases (GRKs), a family of proteins that were initially described by their role in GPCR desensitization. In the present work, we provide new insights into the functional interactions between GRKs and Mitogen Activated Protein Kinases (MAPKs). First, we describe that GRK5 is able to modulate certain G¿12/13-dependent cellular functions through the interaction of GRK5 with this heterotrimeric G protein subunit, which is stabilized by the inactive state of G¿12/13. GRK5 phosphorylation in S114, by ERK MAPK or other kinases, seems to increase the affi nity of GRK5 for the active state of G¿12. In addition, in the beginning of this thesis, we described a new modulatory phosphorylation of p38 MAPK in Thr123, which was carried out by GRK2, that inhibits both p38 activation and activity. In this work, we have detected changes is the inhibitory phosphorylation of p38 by GRK2 in some cellular processes such as adipocytic cell differentiation or in the secretion of infl ammatory cytokines by macrophages in response to lipopolysaccaryde. We have generated a new pool of phospho-antibodies, in order to improve the detection of this phosphorylation, and to explore other cellular processes in which it may be involved. In the majority of the conditions tested, we have not been able to detect any correlation between GRK2 levels, or GRK2 stimulation by different means, and the detection of phospho-T123-p38, which indicates that this phosphorylation might be extremely dynamic, context-specifi c, or modulated by additional factors. Nevertheless, we have detected differences in pT123-p38 levels in isoproterenol-stimulated cardiomyocytes, and also basally in some other cellular types, although the biological meaning of these differences needs to be defi ned in more depth. We have also described that GRK2 interacts with MEK directly, and that this association is stabilized by the active state of MEK. Through this mechanism, GRK2 inhibits the activation of ERK in different cell types such as epithelial cells, splenocytes or astrocytes, mainly in a kinase activityindependent manner. However, GRK2 does not affect ERK phosphorylation in vitro, which together with other results described in this thesis suggests that GRK2 might sequester MEK in particular subcellular localizations. On the other hand, we have analyzed the effect of a chronic and systemic reduction of GRK2 levels in cardiac patho-physiology, using GRK2+/- hemizygous mice as a model. A decrease in GRK2 levels induces the development of an early hypertrohic phenotype, which seems to be of a compensated non-pathological type, since no fi brosis or cardiac dysfunction, as analyzed by echocardiography, were detected. In addition, at the age of 9 months we observe a genetic reprogramming in GRK2+/- mice, with a reduction of some fetal genes indicative of pathological remodelling, and an increase in the transcription of cardioprotective markers. The cardio-protective signalling pathway MEK-ERK is basally over-activated in GRK2+/- mice at the age of 9 months. These mice also show insulin hypersensibility in cardiac tissue, with a higher increase of the phosphorylation of insulin pathway components at different levels in response to an acute insulin treatment. On the contrary, GRK2 levels are increased in blood samples obtained from metabolic syndrome patients. In sum our data support the existence of an inhibition of the insulin pathway by GRK2 at different levels. As this hormone mediates tissue growth and has cardio-protective effects, and taking into account GRK2 inhibits ERK pathway both at a basal state and after insulin stimulation, altogether these fi ndings might explain the fact that in these animals, which express lower GRK2 levels, over-activation of these pathways promotes the development of a compensated heart hypertrophy.