Obtención, caracterización y evaluación del interés como vacunas recombinantes atenuadas de mutantes de Brucella ovis genes relacionados con la membrana externa

Resumen

Brucella ovis produce una enfermedad infecciosa en el carnero caracterizada por la presencia de epididimitis y descenso de la fertilidad, causando elevadas pérdidas económicas en el sector ganadero y para la que no existe una vacuna específica disponible. B. melitensis Rev1, empleada en la prevención de la brucelosis causada por B. melitensis en ganado ovino y caprino, es la vacuna viva atenuada considerada más eficaz frente a la infección heteróloga por B. ovis en ganado ovino. Sin embargo, la vacunación de los animales con B. melitensis Rev1, que posee un lipopolisacárido liso (S-LPS), induce la producción de una respuesta de anticuerpos frente a las cadenas O del S-LPS que es indistinguible de los generados por la infección activa ya que son los detectados mayoritariamente en las pruebas de diagnóstico serológico de las infecciones ocasionadas por cepas lisas de Brucella. Debido a esta interferencia en el diagnóstico serológico, se prohíbe el uso de B. melitensis Rev1 en países o regiones consideradas libres de infecciones por B. melitensis. En base a estos aspectos, el desarrollo de vacunas específicas frente a B. ovis, como alternativa a B. melitensis Rev1 y que permitan la diferenciación serológica entre animales vacunados e infectados (DIVA) presenta gran interés. Considerando que, por su mayor eficacia, las vacunas empleadas frente a otras especies de Brucella son vacunas vivas atenuadas homólogas, es muy probable que una vacuna atenuada homóloga sea también el mejor candidato para la prevención de infecciones por B. ovis. Para el desarrollo de este tipo de vacunas, un aspecto fundamental es el estudio de los factores de virulencia de B. ovis que hasta el momento han sido poco analizados. B. ovis posee un lipopolisacárido rugoso caracterizado por la ausencia de cadenas O (R-LPS) y carece de potencial zoonótico. La ausencia de S-LPS en B. ovis supone un primer rasgo diferencial con las especies zoonóticas más relevantes del género ya que las cadenas O son esenciales para la virulencia de estas últimas, mientras que B. ovis es virulenta tanto en su hospedador preferente como en modelos animales. En este trabajo se ha estudiado el papel de los genes bepC y ugpB en la fisiología y virulencia de la cepa B. ovis PA. Ambos genes se han relacionado con mecanismos extracelulares de virulencia en B. suis 1330, particularmente con resistencia a sales biliares y adhesión bacteriana, respectivamente. En este trabajo se ha comprobado que la inactivación de los genes bepC y ugpB no afecta a la virulencia de B. ovis PA en modelo murino, y que éstos no se relacionan con la supervivencia bacteriana en el interior de macrófagos y células epiteliales o con propiedades de la membrana externa (ME). Estas evidencias ponen de manifiesto diferencias entre la especie naturalmente rugosa B. ovis y la especie lisa B. suis. En este trabajo se ha obtenido un amplio panel de mutantes múltiples de B. ovis PA, combinando genes relacionados con la ME, elemento clave en le virulencia de Brucella. Dentro de las proteínas expuestas en la superficie celular de Brucella se encuentran, de manera minoritaria, las lipoproteínas Omp10 y Omp19, junto con las proteínas mayoritarias Omp25 y Omp31. Si bien su implicación en la virulencia de las distintas especies de este género no está claramente delimitada, se considera que estos elementos contribuyen de forma relevante al mantenimiento de la integridad de la ME. Tras numerosos intentos, no fue posible la obtención de mutantes dobles en los genes omp25 y omp31, y en los genes omp10 y omp19 de B. ovis PA. Estos resultados sugieren que la ausencia simultánea de las proteínas Omp25 y Omp31, y de las lipoproteínas Omp10 y Omp19 podría provocar graves defectos en la ME que impiden la supervivencia de B. ovis PA. Así mismo, en el análisis de la topología de la envuelta celular se observó que la ausencia de los genes omp31 y omp19 provoca alteraciones en el perfil de reactividad de anticuerpos monoclonales que afectan al menos a las proteínas Omp25 y BP26, respectivamente. También se observaron importantes defectos en la penetración en células epiteliales HeLa del mutante doble en los genes omp25 y omp25c que codifican proteínas mayoritarias en la ME de B. ovis, aunque estos genes no están implicados individual, ni conjuntamente en la virulencia de esta cepa en modelo murino. La combinación de mutaciones en genes relacionados con la ME condujo a la obtención de mutantes atenuados en modelo murino, entre los que se seleccionaron los candidatos Domp31Dcgs, Domp10DugpBDomp31 y Domp10Domp31Domp25c, los cuales están marcados con la ausencia del gen de la proteína Omp31 que es un antígeno inmunodominante en la infección por B. ovis y que presenta interés para la diferenciación diagnóstica serológica entre la cepas vacunales y las cepas virulentas. En todas ellas se observaron importantes alteraciones en las propiedades de la ME y en la supervivencia en el interior de macrófagos J774A.1 y células epiteliales HeLa que podrían explicar, al menos en parte, su atenuación. El mutante Domp10DugpBDomp31 presentó un adecuado perfil de persistencia e indujo una respuesta inmune protectora incluso superior a la vacuna heteróloga de referencia B. melitensis Rev1. Considerando la protección conferida en modelo murino, junto con el interés del marcaje diferencial de la cepa vacunal, la vacuna homóloga B. ovis Domp10DugpBDomp31 facilitaría, por un lado, la diferenciación serológica de las infecciones causadas por cepas lisas de Brucella y, por otro, aportaría una ventaja adicional en las campañas de control y erradicación de la infección por B. ovis debido a la ausencia de Omp31. En base a lo expuesto anteriormente, el mutante atenuado Domp10DugpBDomp31 de B. ovis PA constituye un interesante candidato a evaluar en carneros como vacuna homóloga específica frente a la epididimitis contagiosa ocasionada por B. ovis.