Regulación de las características hidráulicas de la raíz por jasmonato de metilo, especies de nitrógeno reactivo y micorrizas arbusculares

Resumen

TITULO DE TESIS DOCTORAL: Regulación de las Características Hidráulicas de la Raíz por Jasmonato de Metilo, Especies de Nitrógeno Reactivo y Micorrizas Arbusculares. AUTOR: Beatriz Sánchez Romera. RESUMEN. Este trabajo de investigación está enfocado al estudio de las propiedades hidráulicas de la raíz, tanto a nivel molecular como a nivel fisiológico y bajo dos regímenes de riego diferentes. Las plantas pueden establecer relaciones simbióticas con organismos del suelo, que afectan la respuesta de las mismas frente a situaciones de estrés. A su vez, en dicha respuesta también intervienen una serie de moléculas señal que actúan estimulando la expresión de genes y la síntesis de proteínas. Entre esas moléculas se encuentran el ácido jasmónico (JA) y el óxido nítrico (NO). Se conoce como el continuo suelo-planta-atmosfera a la ruta que sigue el agua desde el suelo hasta la atmósfera, pasando a través de los tejidos de la planta (Azcon-Bieto 2008). El agua, una vez absorbida por la raíz puede seguir tres vías, la apoplástica, la simplástica y la transcelular. En la vía apoplástica el agua circula de forma continua a través de los poros de la pared celular. En la vía simplástica, el movimiento de agua está mediado por los plasmodesmos que conectan citoplasmas de células adyacentes. Por último, la vía transcelular es aquella en la que el agua fluye a través de las membranas celulares por medio de las acuaporinas (AQP) (Steudle & Peterson 1998). Las acuaporinas son proteínas intrínsecas de membrana implicadas en el transporte pasivo de agua. Sin embargo, ni la vía simplástica ni la vía transcelular pueden cuantificarse por separado por lo que, al conjunto de ambas se le denomina vía célula a célula (Steudle & Peterson 1998). Se conoce como conductividad hidráulica de la raíz (L) a un parámetro que estima la capacidad de transporte de agua de la raíz, el cual depende de la arquitectura de la raíz, de la vía predominante por la que circula el agua y de las propiedades de permeabilidad de las membranas biológicas (Steudle & Peterson 1998; Steudle 2000; Sutka et al. 2011). Desde que se sabe que las acuaporinas están implicadas en la regulación de L, numerosos estudios han sido llevados a cabo para conocer en detalle el papel concreto de estas proteínas (Javot et al. 2003; Postaire et al. 2010; Perrone et al. 2012). Existen diferentes tipos de acuaporinas, aunque las más estudiadas son las proteínas intrínsecas de la membrana plasmática (PIP) que, aunque se encuentran predominantemente en la membrana plasmática, pueden también situarse en las membranas celulares de otros orgánulos como pueden ser la vacuola y el retículo endoplasmático (Maurel et al. 2008; Sorieul et al. 2011). Es sabido que la actividad de las acuaporinas es regulada por los niveles del pH citosólico (Gerbeau et al. 2002), por la concentración de cationes divalentes en el medio (Gerbeau et al. 2002; Alleva et al. 2006), por su estado de fosforilación (siendo su estado activo cuando la acuaporina está fosforilada) (Johansson et al. 1996; Prak et al. 2008), por la formación de heterotetrámeros entre diferentes isoformas de acuaporinas (Fetter et al. 2004), y también ha sido observado una inactivación de las acuaporinas a través de su internalización en vesículas (Boursiac et al. 2008). En condiciones de sequía, el potencial hídrico del suelo se hace tan negativo que las plantas disminuyen su capacidad de absorber agua, al mismo tiempo que la tasa de transpiración es reducida (Breda et al. 1995; Duursma et al. 2008), por lo que los valores de L son también disminuidos (Trifilo et al. 2004; Aroca, Vernieri & Ruiz-Lozano 2008; Gao et al. 2010). Algunos estudios han demostrado que en condiciones de reducida transpiración la vía aploplástica se ve disminuida, ganando mayor importancia el transporte de agua por la vía célula a célula, en la que están implicadas las acuaporinas (Steudle & Peterson 1998; Javot & Maurel 2002). Sin embargo también han sido observados resultados contradictorios (Siemens & Zwiazek 2003, 2004). Por otro lado, el ácido jasmónico (JA) es una hormona que ha sido ampliamente estudiada por su papel en la defensa frente al ataque de patógenos (Creelman & Mullet 1995; Glazebrook 2005). No obstante, también se ha observado que está implicada en la regulación del cierre estomático (Hossain et al. 2011; Munemasa, Mori & Murata 2011), en el establecimiento de la simbiosis micorrícico arbuscular (Hause et al. 2002) y en la tolerancia de la planta frente a varios estreses abióticos como sequía, frío o salinidad (Lee, Parthier & Lobler 1996; Ismail, Riemann & Nick 2012; de Ollas et al. 2013). Sin embargo, no existe ninguna información sobre el efecto regulador de JA o del jasmonato de metilo (MeJA, un compuesto derivado del JA) sobre la conductividad hidráulica de la raíz (L) y sobre la expresión y abundancia de las acuaporinas. El óxido nítrico (NO) forma parte de las conocidas como especies de nitrógeno reactivo, las cuales están implicadas en la señalización celular, cuando se encuentran a bajas concentraciones en las células, y como agentes oxidantes, cuando son producidos como consecuencia de situaciones de estrés (Corpas et al. 2004; Corpas et al. 2011). Por ello, hay estudios donde una dosis adecuada de un donador de NO, como puede ser el nitroprusito sódico (SNP) puede tener un efecto beneficioso en plantas sometidas a estreses abióticos, aumentando la actividad de enzimas antioxidantes (Lamattina et al. 2003; Lamotte et al. 2005; Barroso et al. 2006; Zheng et al. 2009). Sin embargo, cuando el estrés es severo los mecanismos antioxidantes de la planta no pueden hacer frente a los daños ocasionados por el NO sobre proteínas, las cuales dejan de ser funcionales (nitración de proteínas) (Cecconi et al. 2009; Galetskiy et al. 2011; Lozano-Juste, Colom-Moreno & Leon 2011). En relación con las propiedades hidráulicas de la raíz, sólo existe un trabajo donde se observó un aumento de la expresión de cuatro acuaporinas de la membrana plasmática (PIPs) después de una aplicación exógena de SNP (Liu et al. 2007). Otro de los mecanismos que las plantas emplean para superar situaciones de estrés consiste en establecer relaciones simbióticas con hongos micorrícico arbusculares (MA) (Smith & Read 2008). Estos hongos penetran en el interior de las raíces de las plantas y permiten un intercambio de nutrientes y agua entre el hongo y la planta, concretamente el hongo proporciona nutrientes y agua a la planta y ésta le suministra fotoasimilados (Pfeffer et al. 2004; Smith & Read 2008; Smith et al. 2011). Se sabe que los hongos MA proporcionan un mayor aporte de nutrientes y agua a la planta debido a que sus hifas pueden llegar a poros del suelo que son inaccesibles para las raíces de las plantas (Ho & Trappe 1975; Allen, Moore & Christensen 1982; Faber et al. 1991). Del mismo, modo se ha observado que dicha simbiosis proporciona una mejora de la planta cuando ésta está sometida a situaciones de estrés ya que aumenta la actividad de enzimas antioxidantes como son la superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa (CAT) (Palma et al. 1993; Ruiz-Lozano, Azcon & Palma 1996; Porcel, Barea & Ruiz-Lozano 2003; Sohrabi et al. 2012), así como la acumulación de compuestos osmoprotectores como la prolina (Ruiz-Lozano, Gomez & Azcon 1995; Jahromi et al. 2008). En el caso de la simbiosis MA, varios estudios han sido realizados con el objeto de estudiar su papel en la regulación de las propiedades hidráulicas de la raíz (Ruiz-Lozano et al. 2009; Barzana et al. 2012). Marulanda et al. (2003) observó que dos hongos MA mejoraban la absorción de agua en la planta en condiciones de sequía, pero que la estrategia seguida por cada uno de esos hongos fue diferente. En el caso de Funneliformis mosseae, disminuyó la abundancia y la expresión génica de acuaporinas PIPs. Sin embargo, Rhizophagus irregularis no tuvo efecto a nivel de acuaporinas (Porcel et al. 2006). Barzana et al. (2012) en un experimento con plantas de maíz, observaron que la simbiosis MA mejoraba el movimiento de agua a través de la ruta apoplástica tanto en condiciones óptimas de riego como en condiciones de sequía, del mismo modo que fue observada una disminución de la abundancia y expresión de diversas acuaporinas (Porcel et al. 2006; Barzana et al. 2014). También, debemos de tener en cuenta la presencia de las acuaporinas propias del hongo. En el caso de R. irregularis se han encontrado tres acuaporinas diferentes, las cuales han mostrado un aumento de su expresión génica en condiciones de estrés (Aroca et al. 2009; Li et al. 2013) por lo que podrían contribuir al aumento de la absorción del agua en la planta y, por tanto, en la regulación de L. Objetivos. El objetivo general de la tesis doctoral ha sido investigar el papel del ácido jasmónico (JA), el óxido nítrico (NO) y la simbiosis micorrícico arbuscular (MA) en las propiedades hidráulicas de la raíz en plantas sometidas a riego óptimo y a condiciones de sequía. Para lograr el objetivo general, los siguientes objetivos específicos fueron definidos e investigados a lo largo de los capítulos presentados en esta tesis doctoral. 1. Determinar el papel del JA en la regulación de las propiedades hidráulicas de la raíz y la implicación del ácido abscísico y de iones calcio en esta regulación. 2. Estudiar el efecto del NO y el JA en el establecimiento y funcionalidad de hongos MA. 3. Analizar cambios en la expresión y abundancia de acuaporinas causadas por el JA, el NO y los hongos MA en raíces de plantas sometidas a condiciones de riego óptimo y a sequía. 4. Determinar el papel del JA y el NO en las propiedades hidráulicas de la raíz en plantas sometidas a riego óptimo y a sequía. Capítulo 1. Aumento de la conductividad hidráulica de la raíz por metil jasmonato (MeJA) y el papel del calcio y el ácido abscísico en este proceso. En este capítulo se realizaron varios experimentos en condiciones de hidroponía con diferentes tipos de plantas con el fin de constatar el papel del MeJA en la regulación de L. A lo largo de este capítulo se determinó que una aplicación exógena de 100µM de MeJA incrementaba los valores de L en tres tipos de plantas diferentes (alubia, tomate y Arabidopsis). Además, se observó que plantas de tomate deficientes en la acumulación de JA (def-1) disminuyeron L con respecto a plantas silvestres (WT), y que tras una aplicación exógena de MeJA incrementaban los valores de L, aunque no se consiguió restaurar por completo los valores obtenidos en plantas WT. Como L está parcialmente regulada por las acuaporinas (Javot et al. 2003; Postaire et al. 2010; Perrone et al. 2012). Se procedió a la cuantificación de la expresión y abundancia de algunas acuaporinas. Las medidas de la expresión de genes de acuaporinas fueron analizadas por medio de RT-PCR cuantitativa en tiempo real tanto a 1 como a 24 horas tras la aplicación de MeJA. Los resultaron mostraron que tras 1 hora, dos de las seis acuaporinas analizadas disminuyeron su expresión (PvPIP1;2 y PvPIP2;2) y que sólo una fue incrementada (PvPIP2;2). Resultados similares fueron encontrados a las 24 horas, donde dos acuaporinas de seis redujeron su expresión (PvPIP1;3 y PvPIP2;1) y una fue incrementada (PvPIP2;3). Las concentraciones de PIP1, PIP2 y PIP2PH (PIP2 fosforilada en una serina situada en la posición Ser-280) fueron analizadas por técnicas de inmunoensayo. Destacando un aumento de la concentración de PIP2PH causado por la aplicación exógena de MeJA a 1 y 24 horas además de un aumento de la concentración de la PIP2 a las 24 horas. También fueron usadas varias líneas de plantas de Arabidopsis con acuaporinas marcadas con fluorescencia (GFP-PIP1;1, GFP-PIP1;2, GFP-PIP2;2). Los resultados mostraron un aumento de la abundancia en la membrana plasmática de PIP1;2 y PIP2;2 tras la aplicación de MeJA, por el contrario la PIP1;1 fue reducida. En segundo lugar, se quiso comprobar la implicación del calcio y del ácido abscísico (ABA, hormona implicada en la regulación de L (Ruiz-Lozano et al. 2009) y en el cierre estomático (Hossain et al. 2011) en la ruta de regulación de L por MeJA. Por un lado observamos un incremento de calcio citosólico tras la aplicación de MeJA en plantas de alubia tras 24 horas de exposición. Un quelante de calcio (ácido bis (2-aminoetil) etilenoglicol-N,N,N',N'-tetraacético, EGTA) y dos bloqueadores de canales de calcio fueron usados (cloruro de lantano (LaCL3) y heparina) para comprobar el papel del calcio en la respuesta del MeJA sobre L. Aunque el EGTA no tuvo efecto significativo sobre L, el LaCl3, que inhibe canales de calcio de la membrana plasmática, redujo el incremento de L originado por MeJA, pero dicha disminución fue más acusada en plantas tratadas con heparina, que es un bloqueador específico de los canales de calcio mediado por IP3. En cuanto al papel del ABA en la respuesta de MeJA sobre L. Experimentos en alubia con fluoridona (inhibidor de la síntesis de ABA) y plantas de tomate deficientes en ABA (sitiens:(Taylor et al. 1988) mostraron que el incremento de L por MeJA va acompañado por un incremento en la concentración de ABA, sin embargo en ausencia de ABA, el MeJA puede incrementar L, luego estimamos que existen dos vías por las cuales las plantas regulan L, una de las cuales es dependiente de ABA y otra que es independiente. Capitulo 2: La simbiosis micorrícico arbuscular y el jasmonato de metilo evitan la reducción de la conductividad hidráulica de la raíz causada por la sequía. El objetivo de este estudio fue analizar las variaciones que el MeJA puede producir en L y en la expresión y abundancia de las acuaporinas en plantas de P.vulgaris crecidas en macetas con suelo en condiciones de invernadero, sometidas a dos regímenes hídricos (riego óptimo y sequía) e inoculadas o no con un hongo MA. En total había 8 tratamientos, resultado de la combinación de tres factores. Factor biológico, donde la mitad de las plantas no estaban inoculadas y la otra mitad estaban inoculadas con el hongo MA Rhizophagus irregularis. Factor químico, donde hubo plantas sometidas a tres aplicaciones de 200µM de MeJA durante la última semana antes de la cosecha y plantas no tratadas. Y por último un factor abiótico que consistió en someter a la mitad de las plantas a un régimen de sequía durante la última semana antes de la cosecha, mientras el resto de las plantas fueron regadas manteniendo su capacidad de campo. Entre los resultados más relevantes, destacar que ninguno de los tratamientos tuvo efecto en la capacidad colonizadora del hongo MA, del mismo modo que no tuvieron ninguna repercusión en el crecimiento de las plantas. Los valores de L mostraron que la simbiosis MA disminuyó L en condiciones de riego óptimo mientras que la aumentó en condiciones de sequía. Éste último hecho puede estar relacionado con un incremento de la expresión de dos acuaporinas fúngicas (GintAQP1 y GintAQPF2). Además la simbiosis MA mejoró el contenido hídrico relativo independientemente del régimen hídrico al que estaba sometida la planta. En cuanto al papel desempeñado por las acuaporinas de la planta. La expresión de PvPIP1;2 disminuyó en plantas MA en condiciones de riego óptimo. En combinación con MeJA se observó un incremento de la expresión de la PvPIP2;1 y PvPIP2;2 en condiciones de sequía. Por el contrario, el MeJA solo incrementó la expresión de PvPIP1;2 en plantas no MA en condiciones de riego óptimo. En sequía, el MeJA incrementó la expresión de PvPIP1;3 en plantas no MA y PvPIP2;1 en plantas MA, en cambio disminuyó la expresión de PvPIP2;2 en las no AM. Por otro lado, sólo la abundancia de la PIP2PH mostró diferencias significativas entre los tratamientos, destacando una disminución de su abundancia en plantas MA en condiciones de riego óptimo y un aumento de su concentración por la aplicación de MeJA en condiciones de sequía. El conjunto de resultados mostró una correlación positiva entre los resultados de L y la abundancia de PIP2PH. Por último, se determinó la concentración de varias hormonas como el metil jasmonato (MeJA), el ácido jasmónico (JA), el metil salicilato (MeSA), el ácido salicílico (SA), el ácido indolacetico (AIA) y el ácido abscísico (ABA) en cada uno de los tratamientos con el fin de ver su implicación en el papel regulador del MeJA sobre L y la simbiosis MA. Los resultados más destacados fueron, un aumento de AIA en las plantas MA, el cual no fue afectado ni por el régimen hídrico ni por la aplicación de MeJA. Además se observó un aumento de la concentración de ABA sólo en plantas sometidas a sequía y un incremento del contenido de SA en plantas no tratadas ni micorrizadas en condiciones de sequía. Capítulo 3: Implicación de la mutación def-1 en la regulación de la conductividad hidráulica de la raíz por hongos micorrícico arbusculares. El objetivo de este capítulo fue investigar la implicación del contenido endógeno de JA de la planta hospedadora en la actividad reguladora de hongos MA sobre L bajo condiciones óptimas de riego y sequía. Por eso, plantas mutantes de tomate deficientes en la síntesis de JA (def-1:(Howe et al. 1996) y plantas silvestres (WT) fueron crecidas en invernadero, con y sin la inoculación de R. irregularis, como hongo MA, y sometidas a dos regímenes hídricos (riego óptimo y sequía). El diseño experimental está compuesto por tres factores. Factor biológico, consistente en plantas inoculadas con el hongo MA y sin inocular. Factor genotípico, el cual es definido por el uso de plantas WT y plantas mutantes (def-1) y un factor abiótico, donde las plantas tuvieron un riego controlado durante 10 días antes de realizarse la cosecha, siendo la mitad de las plantas regadas hasta su capacidad de campo óptima y la otra mitad hasta un 60% de su capacidad de campo. Los resultados mostraron que ni la sequía ni el genotipo de la planta tuvieron efecto sobre la capacidad colonizadora del hongo MA, aunque si fue observada una disminución de la parte aérea en plantas MA en condiciones de sequía. En cuanto a L, las plantas def-1 obtuvieron valores mayores de L que las plantas WT en condiciones de riego óptimo, y la simbiosis MA mantuvo valores elevados de L independientemente del genotipo de la planta y del régimen hídrico establecido. Además, la simbiosis MA redujo el contenido hídrico relativo e incrementó la conductancia estomática (gs) en condiciones de sequía. Por el contrario, las plantas def-1 sólo incrementaron gs en condiciones de sequía. En relación a las acuaporinas fúngicas, solo se observó un incremento en una de ellas en plantas def-1 en condiciones de riego óptimo. Por el contrario, ocho genes de acuaporinas fueron analizados, y los resultados no mostraron un patrón claro de regulación por hongos MA, genotipo o régimen hídrico. Destacar que la sequía disminuyó la expresión de SlPIP1;1 en todos los tratamientos excepto en plantas MA-WT. Las plantas def-1 aumentaron la expresión de SlPIP1;7, aunque dicho aumento fue reducido en presencia de hongos MA. En cuanto a la expresión de acuaporinas PIP2, la expresión de SlPIP2;1, SlPIP2;8 y SlPIP2;9 fue mayor en plantas def-1 no MA en condiciones de riego óptimo. Por otro lado, la simbiosis MA disminuyó la expresión de SlPIP2;4 y SlPIP2;6 en plantas WT y SlPIP2;1, SlPIP2;6, SlPIP2;8 y SlPIP2;9 en plantas def-1 en condiciones óptimas de riego. En sequía sin embargo, la única diferencia fue un aumento de la expresión de SlPIP2;6 y SlPIP2;9 en plantas WT MA con respecto a las no MA. Los resultados de abundancia de acuaporinas mostraron que la abundancia de PIP1 no fue alterada por ninguno de los tratamientos y que en plantas MA en condiciones de riego óptimo disminuyó la concentración de PIP2 independientemente del genotipo de la planta. La abundancia de la PIP2PH también fue disminuida por la simbiosis MA en todos los tratamientos, excepto en plantas def-1 sometidas a buen riego. Además, en condiciones de buen riego las plantas def-1 también redujeron la concentración de PIP2PH con respecto plantas WT. Por último, destacar un aumento de AIA y MeSA en todos los tratamientos con plantas MA, a excepción de plantas def-1 en condiciones de riego óptimo donde la concentración de MeSA ya era mayor que en las plantas WT sin micorrizar. Por otro lado, el contenido de ABA también fue mayor en plantas MA en condiciones de riego óptimo, y el contenido de SA fue aumentado en todos los tratamientos de sequía, siendo incrementado aun más por la presencia de hongos MA. Capítulo 4: Efecto del SNP (donador de NO) y L-NAME (un inhibidor de la síntesis de NO) en la regulación de la respuesta de la planta a la sequía por hongos micorrícico arbusculares. El objetivo de este capítulo fue investigar la posible implicación del NO en la regulación de la respuesta de las plantas a la sequía y L por la simbiosis MA. Para ello, plantas de lechuga (Lactuca sativa L.) inoculadas o no con R. irregularis y sometidas a dos regímenes hídricos fueron tratadas con un donador de NO (SNP) y un inhibidor de la síntesis de NO (L-NAME) . El diseño experimental estuvo compuesto por tres factores cuya combinación dio lugar a 12 tratamientos diferentes. Factor biológico, determinado por la presencia del hongo MA. Factor químico, con plantas tratadas con SNP (50µM), plantas tratadas con L-NAME (100µM) y plantas sin tratar. Por último un factor abiótico, donde la mitad de las plantas fueron sometidas a un periodo de sequía de una semana antes de la cosecha, mientras que el resto fueron regadas manteniendo óptima su capacidad de campo. Los resultados mostraron que el tratamiento con L-NAME fue el único que mejoró la capacidad colonizadora del hongo MA y mejoró la conductancia estomática, independientemente del régimen hídrico. Mientras que el SNP disminuyó el crecimiento de la parte aérea de las plantas, la conductancia estomática y el contenido de clorofilas en plantas en condiciones de riego óptimo, y aumentó el porcentaje de hojas amarillas. En cuanto a las propiedades hidráulicas de la raíz, se observó que la micorriza mejoró la absorción de agua en plantas sometidas a sequía, excepto en las plantas tratadas con L-NAME donde fue aumentada en condiciones de riego óptimo. El SNP redujo la absorción de agua en condiciones de riego óptimo y redujo el RWC en condiciones de sequía. L fue incrementada por L-NAME en plantas no MA en condiciones óptimas de riego. Sin embargo en condiciones de sequía, los valores de L en plantas MA tratadas con SNP fueron tan reducidos que no se pudo cuantificar. En este experimento sólo se llevó a cabo la cuantificación de la abundancia y expresión génica de las acuaporinas PIP1. Los resultados muestran que las plantas MA redujeron la expresión de LsPIP1 independientemente del tratamiento químico y régimen hídrico. Los tratamientos SNP y L-NAME redujeron su expresión en condiciones de riego óptimo, especialmente en plantas MA. La mayor acumulación de PIP1 se dio en el tratamiento con SNP en plantas no MA en condiciones de riego óptimo, aunque las plantas MA tratadas con SNP mostraron niveles más bajos de PIP1. Además, en condiciones de sequía las plantas no MA mostraron mayor abundancia de PIP1 que las plantas MA, a excepción de las plantas tratadas con L-NAME donde el efecto opuesto fue observado. Discusión. El objetivo de los diferentes estudios incluidos en esta Tesis doctoral fue investigar, tanto a nivel molecular como a nivel fisiológico, la implicación de moléculas señal tales como NO y JA en la regulación de L. Del mismo modo, se ha investigado cómo la simbiosis MA modulaba el efecto de estas moléculas sobre L bajo dos regímenes hídricos. Efecto del MeJA sobre L. Existen evidencias experimentales que demuestran que el MeJA modula la apertura estomática (Hossain et al. 2011; Akter et al. 2012), pero su efecto sobre L no había sido estudiado aún. Plantas de alubia, tomate y Arabidopsis crecidas en hidroponía fueron tratadas con MeJA y en todos ellas se observó un incremento de L después del tratamiento. Es de destacar que plantas mutantes deficientes en JA (def-1 :(Howe et al. 1996; O'Donnell et al. 2003) mostraron valores menores de L que las plantas WT, aunque también incrementaron L después de una aplicación de MeJA, pero no consiguieron alcanzar los valores de las plantas WT. En este estudio, intentamos aplicar los conocimientos adquiridos en los experimentos de cultivo hidropónico a plantas crecidas en suelo en condiciones de invernadero. Los resultados obtenidos en plantas crecidas en suelo no mostraron el mismo patrón que los obtenidos previamente en condiciones de hidroponía. Específicamente, en condiciones de riego óptimo la aplicación de MeJA no tuvo efecto en plantas de alubia y en el caso del tomate, los resultados obtenidos fueron opuestos a los conseguidos por esas mismas plantas en condiciones de hidroponía ya que las plantas def-1 mostraron mayor L que las plantas WT. Este hecho podría ser resultado de cambios en la anatomía de la raíz, como fue demostrado por Matsuo et al. (2009), quienes encontraron diferentes valores de L en plantas de arroz dependiendo de las condiciones en las que fueron cultivadas (hidropónico o en suelo). Es sabido que plantas crecidas en suelo generan depósitos de suberina en sus raíces, por lo que el agua debe fluir por la vía célula a célula (Zimmermann & Steudle 1998; Vandeleur et al. 2009). Ejemplos de ello han sido observados en plantas de arroz tratadas con sal, en donde los depósitos de suberina disminuyeron el transporte de agua por la vía apoplástica (Schreiber, Franke & Hartmann 2005; Krishnamurthy et al. 2011; Ranathunge et al. 2011) y en plantas sometidas a bajas temperaturas, las cuales disminuyeron L como resultado de depósitos de suberina en sus raíces (Lee et al. 2005). Otro punto a considerar es que el método usado para la medida de L fue diferente en ambos tipos de experimentos. En alubias crecidas en suelo, el método de cuantificación usado fue el método de exudación libre el cual sólo cuantifica el transporte de agua por la vía célula a célula debido a que la tasa de transpiración es eliminada con la escisión del tallo. En el experimento de tomate fue usado el método de medida de flujo de alta presión (High Pressure Flow Meter, HPFM) para la cuantificación de L, el cual mide la suma del transporte de agua proveniente de la vía apoplástica y de la vía célula a célula. Sin embargo, en condiciones hidropónicas varios métodos fueron contrastados, obteniendo resultados similares de L. Esto puede ser explicado bien porque ambas rutas contribuyen de forma equitativa o bien porque el aporte de agua proporcionado por la ruta apoplástica es muy pequeño. Aunque en nuestros experimentos en invernadero no comprobamos el efecto de las técnicas de medida de L utilizadas, Barzana et al. (2012) si observó que dependiendo del método usado, los valores de L cambiaron para un mismo tipo de planta. En condiciones de sequía, se observó que plantas de alubia tratadas con MeJA incrementaron L, mientras que plantas def-1 mostraron valores similares a las WT. Lo que sugiere la pregunta de si el JA está implicado en varias rutas de señalización y si su efecto sobre L es la suma de todas ellas. Otra causa de por qué los valores de los experimentos de plantas crecidas en condiciones de invernadero y plantas crecidas en condiciones hidropónicas no pueden ser comparados, está relacionado con el modo de aplicación de los tratamientos químicos. En el caso de las plantas de alubia crecidas en suelo, el MeJA fue aplicado varias veces a lo largo de la semana. En contraste, en condiciones hidropónicas, solo se realizó una aplicación y las plantas fueron cosechadas tras 1 y 24 horas después de la aplicación. Por lo tanto, consideramos que los resultados obtenidos en plantas crecidas en suelo fueron debidos a un efecto de resistencia de estas plantas más que a un efecto inmediato que el MeJA pueda causar sobre L. Además, en condiciones de sequía observamos un incremento de L debido a la aplicación de MeJA y consideramos que puede ser debido a un incremento en la resistencia de la planta frente al estrés, como ha sido previamente demostrado (Anjum et al. 2011; de Ollas et al. 2013). Anjum et al. (2011) observaron que una aplicación de MeJA en plantas de soja incrementó las actividades enzimáticas SOD y CAT, y el contenido de prolina (un osmoregulador) en condiciones de sequía, además de mejorar el estado hídrico de la planta. Por lo tanto, según nuestros resultados, plantas tratadas con MeJA podrían estar mejor preparadas para soportar condiciones de estrés, aunque el tratamiento no reflejara dicho efecto sobre L. Una evidencia de ello fue que las plantas crecidas en sequía y tratadas con MeJA fueron capaces de mantener valores de L similares a las plantas crecidas en condiciones de riego óptimo. Finalmente, plantas deficientes en JA (def-1) tuvieron una mayor L que plantas WT en condiciones de riego óptimo. En contraste, bajo condiciones de sequía no se observó ninguna diferencia en L entre estos dos tipos de plantas. Sugerimos que este resultado fue debido a que la mutación def-1 podría causar una situación de estrés similar al estado de estrés causado por la sequía en plantas WT. Ruta de señalización del MeJA. En este estudio, hemos intentado elucidar por primera vez la ruta de señalización implicada en la regulación de L por MeJA. Se ha observado que el MeJA actúa junto con el ABA y el ion calcio en la regulación de L, como previamente fue descrito para la regulación estomática (Islam et al. 2010; Hossain et al. 2011; Munemasa et al. 2011). De forma similar al MeJA, una aplicación externa de ABA también puede incrementar L (Aroca et al. 2008; Ruiz-Lozano et al. 2009; Kudoyarova et al. 2011). Sin embargo, otros estudios mostraron resultados opuestos (Beaudette et al. 2007). No obstante, L es conocida por ser corregulada por otras hormonas tales como el etileno, cuyos resultados también han sido contradictorios (Islam, MacDonald & Zwiazek 2003), SA, el cual es conocido por inhibir L (Boursiac et al. 2008) y el AIA, cuyo efecto ha sido observado a nivel de acuaporinas y L (Peret et al. 2012). Además, estudios previos han descrito la acción conjunta de ABA y JA en varios procesos tales como defensa frente al ataque de patógenos y en la regulación estomática (Garcia-Andrade et al. 2011; Munemasa et al. 2011). Ha sido en este último estudio donde fue encontrado que la respuesta al JA fue el resultado de la actuación de dos rutas de señalización simultáneas, una de las cuales fue dependiente de ABA y otra fue independiente de ABA (Hossain et al. 2011). El mismo tipo de regulación ha sido observado en nuestro trabajo donde el efecto del MeJA sobre L fue en parte regulado por ABA y en parte independiente de ABA. Sin embargo, De Ollas et al. (2013) observó que el contenido de JA debía ser acumulado previamente para que tuviera lugar un incremento de la concentración de ABA en las raíces en condiciones de sequía. Por otro lado, Sun et al. (2009) observaron un incremento en la concentración de calcio citosólico en respuesta a una aplicación exógena de MeJA, con el fin de comenzar una ruta de señalización que podría resultar en un incremento de la expresión de genes, síntesis de proteínas o de modificaciones postraduccionales de proteínas. Del mismo modo, nuestros resultados mostraron que la mejora de L causada por MeJA podría ser mediada por la movilización de calcio proveniente de almacenamientos internos, concretamente de aquellos con canales de calcio dependientes de IP3, los cuales están localizados en el retículo endoplasmático y en el tonoplasto y son inhibidos por la heparina (White 2000; Poutrain et al. 2009; Sun et al. 2009). Papel de la simbiosis MA en el estado hídrico de la planta. La simbiosis MA proporciona a la planta hospedadora varias ventajas que le permiten sobrevivir y tolerar mejor las condiciones de estrés. Por ejemplo, los hongos MA son capaces de captar el agua del suelo que es inaccesible para las raíces de las plantas y regulan la tasa de transpiración (Allen 1991; Faber et al. 1991; Ebel et al. 1997). Por lo tanto, la simbiosis MA ha sido ampliamente estudiada en una gran variedad de plantas y frente a varios estreses abióticos. En nuestros experimentos, en primer lugar notamos que ni el JA ni la sequía afectaron al porcentaje de micorrización. Sin embargo, un inhibidor de la síntesis de NO (L-NAME) incrementó la efectividad de colonización fúngica. Calcagno et al. (2012) observó un incremento de los niveles de NO en la raíz durante la fase inicial de colonización por hongos MA. Sin embargo, este incremento puede ser transitorio y mantenerlo podría causar una inhibición de la proliferación de hifas del hongo como ocurrió cuando en este estudio añadimos L-NAME durante un largo periodo de exposición. A pesar de la falta de respuesta del MeJA en nuestro trabajo, otros estudios mostraron resultados contradictorios. Por un lado, hay estudios donde se observó un incremento en la concentración de JA en plantas MA y específicamente en las células que contenían arbúsculos (Hause et al. 2002). Por el contrario, Isayenkov et al. (2005) encontraron que bajos niveles de JA disminuyeron la tasa de micorrización y la formación de arbúsculos. Ludwing-Muller et al. (2002) observó una reducción de la colonización fúngica después de una aplicación exógena de MeJA y en consecuencia se redujo el número de arbúsculos (Herrera-Medina et al. 2008). Por lo tanto, nosotros consideramos que el JA está implicado en el establecimiento y desarrollo de la simbiosis, pero su efecto podría variar dependiendo del tipo de planta y de las condiciones ambientales. A nivel de biomasa, las tres especies de plantas analizadas no mostraron una mejora significativa en el crecimiento causado por la simbiosis MA. De hecho, plantas de tomate MA crecidas en condiciones de sequía fueron más pequeñas que las no MA. Así en la presente tesis, el efecto promotor del crecimiento por la simbiosis MA observado normalmente (Ruiz-Lozano et al. 2009; El-Mesbahi et al. 2012), no fue conseguido en este trabajo. Una posible explicación puede ser que la planta no sufriera limitación nutricional y, por lo tanto, los efectos nutricionales del hongo no se hicieran notar. De hecho, como se ha observado previamente, elevadas concentraciones de fósforo en el suelo reducen la capacidad colonizadora del hongo, la cual es mejorada cuando la concentración del fósforo en el suelo es limitada (Smith & Read 2008). En relación con L, la presencia de hongos MA la incrementó en plantas de tomate (WT) y la disminuyó en plantas de alubia en condiciones de riego óptimo, aunque nosotros debemos tener en cuenta que el método de medida de L fue diferente en cada experimento. Sin embargo, los hongos MA mejoraron L en ambas plantas en condiciones de sequía, como había sido descrito previamente (Barzana et al. 2012; El-Mesbahi et al. 2012). Por otro lado, en plantas de lechuga, los hongos MA no tuvieron efecto sobre L. Sin embargo, en el tratamiento de SNP el transporte de agua por la vía célula a célula fue inhibido completamente en condiciones de sequía en plantas MA. Por lo tanto, los niveles endógenos de NO podrían afectar tanto a la colonización del hongo como a la regulación de L por el mismo. Regulación de las acuaporinas por MeJA, hongos MA, sequía y NO. La regulación de las acuaporinas por los diferentes tratamientos siguió un patrón complejo. En el caso de plantas de alubias crecidas en hidropónico sólo tres de seis acuaporinas fueron reguladas por la aplicación de MeJA, dos de ellas disminuyeron su expresión y sólo una la incrementó. En plantas de alubia crecidas en suelo en condiciones de riego óptimo, cinco de seis genes de acuaporinas no fueron afectados por el tratamiento con MeJA, y cinco de ocho genes tampoco cambiaron en plantas de tomate def-1. Del mismo modo, en plantas sometidas a sequía, cuatro de seis genes en plantas de alubia y seis de ocho genes en plantas de tomate permanecieron inalterados. Luego, podríamos decir que el papel del JA es limitado a nivel de regulación en la expresión génica de acuaporinas. En cuanto a la abundancia de acuaporinas, el MeJA tuvo mayor efecto. Ejemplo de ello fue observado cuando plantas de arabidosis que expresaban acuaporinas marcadas con GFP mostraron una disminución en la abundancia de PIP1;1 en la membrana plasmática tras la aplicación de MeJA y un incremento en la abundancia de PIP1;2 y PIP2;2. Estudios previos han confirmado que la presencia de heterotetrámeros con PIP1;2 y PIP 2;5 fueron capaces de incrementar los valores de permeabilidad de la membrana en ovocitos de Xenopus laevis. Por otro lado, PIP1;1 tiende a ser internalizado en vesículas y en el interior del retículo endoplasmático bajo condiciones de estrés o cuando están inactivas (Boursiac et al. 2008). En general, PIP1;1 es conocida por transportar menor cantidad de agua que la PIP 1;2 y la PIP 2;2 (Fetter et al. 2004; Zelazny et al. 2007). Es importante destacar que el MeJA actúa principalmente en la regulación del estado de fosforilación de las acuaporinas PIP2s (PIP2PH) ya que es sabido que la fosforilación en la Ser-280 proporciona un estado activado de las acuaporinas que permite el transporte de agua (Johansson et al. 1998). En nuestros resultados, la abundancia de PIP2PH fue mayor en plantas tratadas con MeJA en condiciones hidropónicas. En plantas de alubias crecidas en condiciones de invernadero, la abundancia de la PIP2PH disminuyó en condiciones de sequía, aunque fue incrementada después de la aplicación de MeJA. Por último, en plantas de tomate crecidas en invernadero, las plantas deficientes en JA, redujeron la abundancia de PIP2PH en condiciones de riego óptimo. En general, estos resultados sugieren que el MeJA está implicado en la regulación del estado fosforilado de la Ser-280 en acuaporinas PIP2 y que ésta podría ser su principal función en la regulación de L. La simbiosis MA es conocida por disminuir la expresión y abundancia de la mayoría de las acuaporinas (Barzana et al. 2014). En nuestro estudio observamos que la concentración de PIP2 y PIP2PH fue reducida en plantas de tomate WT MA y la PIP2PH en plantas de alubia en condiciones de riego óptimo. En cuanto a la expresión génica, PvPIP1;2 en alubia y SlPIP2;4 y SlPIP2;6 en tomate fueron reguladas negativamente por la simbiosis MA en condiciones de riego óptimo. Sin embargo, seis genes de acuaporinas en tomate y cinco genes de acuaporinas en alubias se mantuvieron inalterados. En condiciones de sequía, los resultados obtenidos siguieron diferentes patrones. Aunque no hubo cambios en la expresión de acuaporinas en plantas de alubia, la expresión génica de tres de ocho genes fue incrementada en plantas de tomate MA. En el experimento realizado con plantas de lechuga, observamos que tanto la expresión como la abundancia de PIP1 fueron reducidas por la simbiosis MA independientemente del régimen hídrico. De ese modo, y como estudios anteriores abalan (Aroca, Porcel & Ruiz-Lozano 2007), parece ser que cada gen de acuaporina tiene una respuesta específica para la simbiosis AM y para determinadas condiciones ambientales. En nuestro trabajo también hemos tenido en cuenta el posible papel de las acuaporinas fúngicas en el transporte de agua hacia la planta. Concretamente, tres acuaporinas han sido descritas en Rhizophagus irregularis hasta la fecha (Aroca et al. 2009; Li et al. 2013). Nuestros resultados mostraron un aumento de la expresión de dos genes cuando las plantas de alubia fueron sometidas a sequía, estos resultados concuerda con aquellos encontrados por Aroca et al. (2009) y Li et al. (2013). Sin embargo, la sequía no tuvo ningún efecto en el experimento de plantas de tomate, aunque cabe destacar un aumento de expresión de una acuaporina fúngica (GintAQP1) en plantas def-1 en condiciones de riego óptimo, la cual podría ser regulada por los niveles endógenos de JA que posee la planta. Los productos químicos aplicados para cambiar la concentración endógena de NO (L-NAME y SNP) también tuvieron un efecto en la abundancia y expresión de acuaporinas. El efecto más remarcable fue que ambos productos químicos redujeron la expresión de LsPIP1 y que el SNP incrementó la abundancia de PIP1 en condiciones de riego óptimo. Liu et al. (2013) observó un aumento de la expresión de cuatro genes de acuaporinas tras una aplicación de SNP y GSNO pero no existe más información sobre el efecto del NO sobre la expresión de acuaporinas hasta el momento. Interacción entre hormonas. Este es uno de los pocos estudios donde una variedad de hormonas ha sido analizada simultáneamente con el fin de comprender las interacciones establecidas entre ellas. Considerando todos los resultados obtenidos, podemos enfatizar algunos aspectos que no han sido descritos previamente en la literatura. El primero es el incremento en los niveles de AIA observados en plantas de alubia y de tomate (WT) mediados por la micorrización, el cual puede estar relacionado con una disminución en la expresión de acuaporinas que es con frecuencia vinculado tanto a la presencia de hongos MA (Porcel et al. 2006; Barzana et al. 2014) como también a una aplicación exógena de AIA (Peret et al. 2012). Además, un incremento de AIA podría ser una posible estrategia usada por las plantas micorrizadas para reducir el flujo de agua radial a través de la vía célula a célula e incrementar el flujo de agua a través de la vía apoplástica, favoreciendo una u otra ruta dependiendo de las condiciones ambientales presentes (Barzana et al. 2012). Tras la realización de los análisis de regresión, observamos que existía una correlación lineal positiva entre la concentración de MeSA y L, la cual no había sido descrita previamente. Del mismo modo, observamos que un incremento de la concentración de MeSA podría regular negativamente la concentración de acuaporinas PIP1, un grupo de acuaporinas que es conocido por tener una menor capacidad transportadora de agua que las PIP2 (Fetter et al. 2004; Zelazny et al. 2007). Estos resultados sugieren la necesidad de llevar a cabo nuevos estudios que nos ayuden a comprender el papel de MeSA en la regulación de L y en la regulación de las acuaporinas. Finalmente, discutir el efecto observado sobre el SA. El papel más importante de SA es su implicación en la resistencia sistémica adquirida contra estreses bióticos (Forchetti et al. 2010; Donovan, Nabity & DeLucia 2013) y, en menor medida, contra estreses abióticos (Farooq et al. 2009; Kang et al. 2013). Además, el SA es considerado una hormona con un efecto antagónico al del JA, aunque ambas hormonas podrían actuar conjuntamente en algunos procesos (Proietti et al. 2013). Aquí observamos que plantas de alubia y tomate (WT) sometidas a sequía mostraron elevados niveles de SA con respecto a las plantas que no fueron sometidas a condiciones de estrés. En el caso de plantas de alubia, una correlación negativa fue observada entre la concentración de SA y los valores de L. Esta interacción puede ser explicada por la internalización de acuaporinas en vesículas causadas por SA, como Boursiac et al. (2008) describió anteriormente. Por lo tanto, sugerimos que las plantas micorrizadas y los niveles endógenos de JA en la planta podrían regular el contenido de SA en la planta con el fin de tener un efecto sobre L. Conclusiones: 1. La aplicación de 100 ¿M de MeJA incrementó L en plantas de alubia, tomate y Arabidopsis en condiciones de hidroponía. 2. El ABA y el calcio citosólico están parcialmente implicados en la ruta de señalización del JA implicada en la regulación de L. 3. El JA disminuyó la expresión de la mayoría de las acuaporinas. Por el contario, el JA incrementó la concentración de la forma activa de las acuaporinas, aumentando la forforilación del residuo de serina situado en la posición 280. 4. El grado de colonización radical por los hongos micorrícico arbusculares no fue afectado por JA. Sin embargo, el uso de un inhibidor de la síntesis de NO si mejoró el grado de colonización por los hongos micorrícico arbusculares. 5. Un incremento en la concentración de AIA en las raíces micorrizadas podría ser responsable de la disminución en la expresión y abundancia de acuaporinas asociadas con la simbiosis MA y el incremento de la circulación del agua por la via apoplástica. 6. Plantas tratadas con MeJA y plantas inoculadas con Rhizophagus irregularis mejoraron los valores de L en condiciones de sequía, probablemente como resultado de una regulación del contenido endógeno de SA. 7. El posible papel positivo del MeSA en la regulación de L y en la disminución de la cantidad de PIP1 es postulado por primera vez. Bibliografía Akter N., Sobahan M.A., Uraji M., Ye W., Hossain M.A., Mori I.C., Nakamura Y. & Murata Y. (2012) Effects of depletion of glutathione on abscisic acid- and methyl jasmonate-induced stomatal closure in Arabidopsis thaliana. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 76, 2032-2037. Allen M.F. (1991) The ecology of mycorrhizae. Cambridge University Press. Allen M.F., Moore T.S. & Christensen M. 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