Tratamiento con células troncales mesenquimales alogénicas en el infarto cerebral. Opciones de la administración intravenosa y fuente de tejido adiposo

Resumen

Actualmente, además de los cuidados del ictus agudo, sólo la trombolisis intravenosa (i.v.) y reperfusión ha demostrado ser un tratamiento eficaz en el infarto cerebral (IC), aunque debido a su corta ventana terapéutica, sólo un pequeño porcentaje de pacientes puede beneficiarse de éste. Por ello, es necesario investigar nuevas terapias que favorezcan la reparación de la unidad neurovascular y recuperación funcional después del IC. La plasticidad cerebral contiene mecanismos de reparación que se activan tras una lesión y que podrían estimularse mediante rehabilitación, así como la administración de factores tróficos y la terapia celular. Ésta última, podría ser una alternativa en el tratamiento del IC, sin embargo, es necesario profundizar en el estudio de ésta con modelos animales experimentales para poder responder a aspectos relacionados con las rutas de administración y las fuentes celulares idóneas para una posterior traslación clínica. En un principio se planteó que la terapia celular idónea era la de procedencia autóloga, ya que no produciría rechazo inmunológico. Sin embargo, su principal limitación es que al precisar tiempo para su cultivo, sólo sería posible aplicarla varias semanas después del IC y no podría administrarse durante la fase aguda. Pero hoy en día, se ha demostrado que la fuente alogénica es segura y no genera problemas de incompatibilidad inmunológica, teniendo la ventaja de poder ser utilizada en fases tempranas del IC al disponer del material celular listo y pendiente sólo de su expansión. Con respecto a las vías de administración, se han utilizado diversas rutas en modelos animales experimentales, siendo la mayor parte de ellas invasivas como la intracerebral, ya que se pensaba que era necesaria la llegada de las células al parénquima lesionado para obtener un efecto favorable sobre la reparación tisular. Sin embargo, existen otras vías menos invasivas como la intracarotídea (i.c.) y la i.v. que podrían ser igualmente eficaces para su administración y, por tanto, más adecuadas para su traslación a la clínica. En cuanto a la estirpe celular, se han utilizado células embrionarias, neurales, hematopoyéticas y células troncales mesenquimales (CTM), mostrando todas eficacia, aunque algunas son de difícil obtención y plantean problemas éticos. Las CTM, gracias a su fácil disponibilidad, bajo grado de rechazo inmunológico y que su uso no conlleva conflictos éticos, podrían ser buenas candidatas para la traslación clínica. Las CTM se encuentran en la mayoría de los tejidos adultos y se pueden aislar de diferentes fuentes como médula ósea y tejido adiposo entre otras. La fuente de tejido adiposo es realmente abundante y accesible obteniéndose a partir de lipoaspirados por motivos terapéuticos. Hipótesis: La administración intracerebral de células troncales alogénicas en modelos de infarto cerebral en animales de experimentación ha mostrado un efecto favorable en la recuperación funcional. Sin embargo, la administración i.c. o i.v de células troncales mesenquimales alogénicas derivadas de médula ósea o tejido adiposo también podría favorecer la recuperación funcional tras el infarto cerebral experimental por oclusión permanente de la arteria cerebral media, posiblemente, a través de la estimulación de mecanismos de protección y reparación en el cerebro lesionado. Objetivos: En un modelo experimental en ratas de infarto cerebral agudo por oclusión permanente de la arteria cerebral media pretendemos: 1. Analizar el efecto de la administración i.c. e i.v. de CTM alogénicas derivadas de médula ósea sobre la recuperación funcional. 2. Comparar el efecto terapéutico de la administración i.v. de CTM alogénicas derivadas de tejido adiposo (CTM-TA) frente a CTM alogénicas derivadas de médula ósea (CTM-MO). 3. Analizar los mecanismos de protección y reparación cerebral por los que la administración por vía hemática de CTM-MO y CTM-TA alogénicas podrían favorecer la recuperación funcional. Material y métodos: Se utilizaron ratas macho adultas Sprague-Dawley (250-320g) distribuídas en 7 grupos (n=10/grupo): 1) sham i.v.; 2) sham i.c.; 3) control i.v.; 4) control i.c.; 5) CTM-MO i.v.; 6) CTM-MO i.c; 7) CTM-TA i.v. Los animales sham fueron sometidos a todo el procedimiento quirúrgico a excepción de la isquemia cerebral y se les administró suero salino por vía i.v. o i.c. El resto de animales fueron sometidos a oclusión permanente de la arteria cerebral media (OpACM) con ligadura transitoria de arterias carótidas comunes (ACC) durante 60min y a los 30min después de la desoclusión de las mismas se administró a los grupos control suero salino por vía i.v. e i.c. y a los grupos de tratamiento, CTM-MO (2x106 células) por vía i.v. e i.c. y CTM-TA (2x106 células) por vía i.v. Los animales se sacrificaron a los 14 días. Tras la obtención de CTM procedentes de médula ósea y tejido adiposo en ratas adultas Sprague-Dawley, se llevó a cabo el aislamiento y caracterización de éstas por citometría de flujo. En las ratas objeto de estudio, se realizó a las 24h la evaluación funcional mediante la escala de Rogers y el test de Rota-Rod, así como la implantación celular y tamaño de lesión se estudiaron mediante Resonancia Magnética (RM). A los 14 días se analizó: la evaluación funcional mediante la escala de Rogers y el test de Rota-Rod, así como la implantación celular por RM e inmunofluorescencia, tamaño de lesión por RM y Hematoxilina-Eosina (H&E), muerte celular por TUNEL, proliferación celular por 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU), citocinas pro-inflamatorias (TNF-alpha e IL-6) en plasma, nº de vasos sanguíneos y co-marcajes de DiI y BrdU por inmunofluorescencia, marcadores de reparación cerebral: neurofilamento (NF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), factor de transcripción 2 de oligodendrocitos (Olig-2), sinaptofisina (SYP) y factor de 3. Analizar los mecanismos de protección y reparación cerebral por los que la administración por vía hemática de CTM-MO y CTM-TA alogénicas podrían favorecer la recuperación funcional. Material y métodos: Se utilizaron ratas macho adultas Sprague-Dawley (250-320g) distribuídas en 7 grupos (n=10/grupo): 1) sham i.v.; 2) sham i.c.; 3) control i.v.; 4) control i.c.; 5) CTM-MO i.v.; 6) CTM-MO i.c; 7) CTM-TA i.v. Los animales sham fueron sometidos a todo el procedimiento quirúrgico a excepción de la isquemia cerebral y se les administró suero salino por vía i.v. o i.c. El resto de animales fueron sometidos a oclusión permanente de la arteria cerebral media (OpACM) con ligadura transitoria de arterias carótidas comunes (ACC) durante 60min y a los 30min después de la desoclusión de las mismas se administró a los grupos control suero salino por vía i.v. e i.c. y a los grupos de tratamiento, CTM-MO (2x106 células) por vía i.v. e i.c. y CTM-TA (2x106 células) por vía i.v. Los animales se sacrificaron a los 14 días. Tras la obtención de CTM procedentes de médula ósea y tejido adiposo en ratas adultas Sprague-Dawley, se llevó a cabo el aislamiento y caracterización de éstas por citometría de flujo. En las ratas objeto de estudio, se realizó a las 24h la evaluación funcional mediante la escala de Rogers y el test de Rota-Rod, así como la implantación celular y tamaño de lesión se estudiaron mediante Resonancia Magnética (RM). A los 14 días se analizó: la evaluación funcional mediante la escala de Rogers y el test de Rota-Rod, así como la implantación celular por RM e inmunofluorescencia, tamaño de lesión por RM y Hematoxilina-Eosina (H&E), muerte celular por TUNEL, proliferación celular por 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU), citocinas pro-inflamatorias (TNF-alpha e IL-6) en plasma, nº de vasos sanguíneos y co-marcajes de DiI y BrdU por inmunofluorescencia, marcadores de reparación cerebral: neurofilamento (NF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), factor de transcripción 2 de oligodendrocitos (Olig-2), sinaptofisina (SYP) y factor de tamaño de lesión con respecto al grupo control, aunque sí se observó una reducción de la muerte celular así como, un aumento de la proliferación significativo en la zona de peri-infarto con respecto al grupo control (P<0,05). El grupo sham no mostró proliferación ni muerte celular ya que no se encontraron células con marcaje positivo para BrdU ni TUNEL. Los marcadores de respuesta inflamatoria en plasma a los 14 días, mostraron un claro aumento de TNF-alpha e IL-6 en los grupos de tratamiento con CTM-MO y CTM-TA (P<0,05). Por último, el estudio de los marcadores de reparación cerebral en la zona peri-infarto a los 14 días después del IC demostró en ambos grupos de tratamiento, CTM-MO y CTM-TA, un incremento evidente de la expresión de NF, Olig-2, SYP y VEGF, así como una reducción del marcador glial GFAP (P<0,05). Conclusiones: En un modelo experimental en ratas de infarto cerebral agudo por oclusión permanente de la arteria cerebral media observamos: 1. La administración de células troncales mesenquimales alogénicas tanto por vía intracarotídea como intravenosa, es eficaz en la recuperación funcional. 2. El tratamiento con células troncales mesenquimales alogénicas procedentes de tejido adiposo es tan eficaz como las procedentes de médula ósea para favorecer la recuperación funcional. 3. La administración por vía hemática de células troncales mesenquimales alogénicas derivadas de médula ósea y tejido adiposo favorecen la recuperación funcional al potenciar mecanismos protectores (disminución de muerte celular y de gliosis) y reparadores (aumento de proliferación celular y expresión de marcadores implicados en neurogénesis, oligodendrogénesis, sinaptogénesis y angiogénesis) de la lesión cerebral.