Análisis de la contribución de los mecanismos efectores de las células citotóxicas en la inmunidad antitumoral

Resumen

Entre los diferentes mecanismos de la inmunidad antitumoral, las células asesinas naturales o NK (Natural Killer) y los linfocitos T citotóxicos (Tc) juegan un papel importante tanto en el reconocimiento como en la eliminación de las células tumorales (Dunn et al., 2004; Koebel et al., 2007; Vesely et al., 2011). Los mecanismos por los cuales estas células efectoras reconocen a las células diana y se activan son distintos en cada caso. Mientras las células NK generan una respuesta, sin sensibilización previa, mediante la integración de un complejo sistema de señales de activación y de inhibición (Anel et al., 2012; Lanier, 2005; Moretta et al., 2008), los linfocitos tienen que ser activados a través de su TCR (receptor de células T) que reconoce un péptido antigénico presentado por las células presentadoras de antígeno (APC) a través del MHC. Esto genera una respuesta específica frente a las células diana que presentan ese antígeno (Smith-Garvin et al., 2009). En ambos casos, existe una molécula que juega un papel fundamental en los procesos de reconocimiento: el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I o MHC-I. En el caso de las células NK, el MHC-I expresado por las células diana actúa como señal inhibitoria, de forma que en ausencia (o notable disminución) de esta molécula y presencia de otras moléculas activadoras (como NKG2D), se produce la activación de las células NK y la lisis de la célula diana (Lanier, 2005; Moretta et al., 2008; Vivier et al., 2011; Waldhauer and Steinle, 2008). En el caso de los linfocitos T CD8+, el MHC-I es la molécula encargada de presentar los péptidos antigénicos, bien en las APC o bien en el resto de células (Smith-Garvin et al., 2009). Tras la activación de la célula efectora, bien por el TCR en el caso de linfocitos Tc, o bien a través de las señales a de activación/inhibición en las células NK, se llevan a cabo los mecanismos efectores a través de 2 vías diferenciadas que, en este caso, sí que son compartidas por ambas células efectoras: 1) síntesis y liberación de moléculas solubles como el interferón (IFN-¿) y el factor de necrosis tumoral (TNF-¿), 2) inducción de muerte celular programada o apoptosis en la célula infectada o transformada mediante dos vías citolíticas distintas (degranulación de vesículas citotóxicas e inducción de ligandos mortales)(Kagi et al., 1994b; Pardo et al., 2008a; Russell and Ley, 2002; Waldhauer and Steinle, 2008). En el caso de la exocitosis de gránulos citotóxicos, estas vesículas contienen, entre otras moléculas, perforina (perf) y granzimas (gzms), que son las principales moléculas efectoras de inducir la muerte de la célula. La perf es una molécula formadora de poros responsable de la entrada de las gzms al interior celular. Desde poco después de su descubrimiento a mediados de los 80, se demostró que la perf jugaba un papel importante en la defensa del sistema inmune frente a virus (Kagi et al., 1994a; Mullbacher et al., 1996) y tumores (Bolitho et al., 2009; Smyth et al., 2000; van den Broek et al., 1996), ya que, aunque las principales moléculas ejecutoras de la apoptosis en estas células son las gzms, las células efectoras pierden su capacidad citotóxica en ausencia de esta proteína formadora de poros (Kagi et al., 1994a; Pardo et al., 2004; Shi et al., 2005). Por este motivo, muchos han sido los estudios encaminados a saber cuál es el mecanismo por el que la perf facilita la entrada de las gzms a la célula diana, habiéndose propuesto dos mecanismos principales. El primer mecanismo propone que la perf formaba del poro directamente en la membrana plasmática de la célula para permitir la entrada de las gzms al interior celular. El segundo mecanismo establece que la perf y las gzms son endocitadas y es en este endosoma donde la perf crea unos poros para liberar las gzms al citosol. En nuestros resultados, queda demostrado que la perf liberada por linfocitos Tc es capaz de anclarse en la membrana lipídica de la célula diana e interaccionar con ella formando unas estructuras proteico-lipídicas (Metkar et al., 2011). Estos poros, que permiten el paso de moléculas como el IP, podrían facilitar la internalización de las gzms a la célula diana sin necesidad de un mecanismo de endocitosis. Las gzms son una familia de serín proteasas contenidas en los gránulos de células efectoras de la inmunidad innata y adquirida. Están implicadas en multitud de procesos como inflamación (Anthony et al., 2010; Joeckel et al., 2011; Metkar et al., 2008; Pardo et al., 2009), inhibición de la replicación viral (Andrade et al., 2007; Knickelbein et al., 2008), mantenimiento de la homeostasis del sistema inmune (Cao et al., 2007; McHugh et al., 2002), proteolisis de la matriz extracelular (Buzza et al., 2005; Pardo et al., 2007; Simon et al., 1991; Yoshikawa et al., 2008), etc. Pero sin duda el más estudiado y mejor caracterizado es la inducción de la muerte de la célula por apoptosis. No todas las gzms descritas tienen funciones proapoptótica; en principio éstas eran atribuidas tanto a la gzmA como a la gzmB (Lieberman, 2010; Pardo et al., 2002a; Pardo et al., 2004), pero se ha demostrado que la principal proteasa responsable de inducir la muerte en la célula diana es la gzmB (Ebnet et al., 1995; Metkar et al., 2008; Pardo et al., 2008b). Actualmente a la gzmA se le adjudica una función pro-inflamatoria al demostrarse que es capaz de inducir la liberación de IL-1ß, TNF-¿ e IL-6 en macrófagos en ausencia de muerte celular (Anthony et al., 2010; Froelich et al., 2009; Metkar et al., 2008; Pardo et al., 2009). Apoyando esta última teoría, se ha demostrado que en ninguna de las condiciones ensayadas en este trabajo in vivo, se ha observado muerte dependiente de la gzmA, siendo la primera vez que se demuestra, in vivo, que la gzmA no tiene una función citotóxica, al menos sobre células EL4. En estudios iniciales del mecanismo de acción de la gzmB sobre diversas líneas tumorales, se estableció que dicha proteasa es capaz de actuar mediante diversas vías para inducir la muerte de la célula diana. Así pues, la gzmB es capaz de actuar directamente sobre las caspasas ejecutoras (Pardo et al., 2008b) o sobre la mitocondria, de forma dependiente (Pardo et al., 2008b; Thomas et al., 2001) o independiente de caspasas (Alimonti et al., 2001; Heibein et al., 2000; Pardo et al., 2008b). En este sentido, también han aparecido resultados en los que la gzmB humana es capaz de proteolizar el complejo Bim-Mcl-1 liberando la proteína proapoptótica que inducirá muerte de forma dependiente de la mitocondria pero independiente de Bid (Han et al., 2004; Han et al., 2005). Cabe destacar que se demostró in vitro, que la gzmB humana tiene preferencia por Bid mientras que la de ratón tiene preferencia por la caspasa 3 (Casciola-Rosen et al., 2007; Cullen et al., 2007; Kaiserman et al., 2006). La aparición de numerosos resultados contradictorios puede ser debida a que la mayor parte de los estudios se han realizado con proteínas purificadas de diferentes especies, y en pocas ocasiones se han utilizado células intactas. Por todo esto, el mecanismo por el cual la gzmB provoca la muerte de la célula diana sigue siendo un motivo de controversia. Utilizando linfocitos Tc obtenidos ex vivo se ha demostrado que que la gzmB induzca apoptosis en una célula a través de un mecanismo u otro puede depender además del tipo de transformación que haya sufrido la célula. En nuestro caso, según los MEF hayan sido transformados de forma espontánea (MEF 3T9) o por el antígeno T del SV40 (MEF SV40), el mecanismo predominante por el cual actúa la gzmB varía. Los MEF SV40 son capaces de llevar a cabo la apoptosis de forma independiente de la mitocondria, hecho que concuerda con resultados anteriores (Pardo et al., 2008b). Por el contrario, en los MEF 3T9 la gzmB sólo es capaz de inducir muerte a través de la vía mitocondrial de apoptosis. Además en estas células, esta vía mitocondrial es iniciada por Bim en lugar de Bid como ocurre en otras líneas tumorales. Así pues, existe un gran debate sobre el papel de la ruta de apoptosis mitocondrial en la muerte inducida por la gzmB (Hoves et al., 2010). Con experimentación in vivo, se analizó la sensibilidad de la línea EL4.Bcl-XL a los linfocitos Tc gzmB+. En nuestros resultados se demuestra que, a pesar de que la sobre expresión de Bcl-XL confiere resistencia a estas células frente a diversas drogas citotóxicas, no es capaz de proteger de la apoptosis inducida por linfocitos Tc gzmB. Estos datos correlacionan con resultados previos utilizando otros tipos celulares in vitro (Thomas et al., 2001) y ex vivo (Pardo et al., 2008b), apoyando la teoría de que la gzmB es capaz de inducir la muerte de la célula diana de forma independiente de la mitocondria. Según estableció Otto Warburg en 1956, algunas células tumorales metabolizan la glucosa a través de la fermentación hasta lactato en vez de mediante la fosforilación oxidativa (OXPHOS), lo que se denominó ¿efecto Warburg¿ (Warburg, 1956). Este fenotipo glucolítico les confiere a las células una serie de ventajas (Hsu and Sabatini, 2008), como un aumento en la capacidad de división de la células tumorales (Levine and Puzio-Kuter, 2010; Vander Heiden et al., 2009) además de favorecer la progresión del tumor (Fischer et al., 2007; Gatenby and Gillies, 2004). El grupo de Martín Villalba, del IRB de Montpelier, en colaboración con el nuestro, ha establecido que esta tendencia hacia la glucólisis, a través de la desactivación de la quinasa ERK5, produce una bajada en la expresión del MHC-I en las células tumorales, y que tratamientos que fuerzan a la célula tumoral a la utilización de la vía OXPHOS mitocondrial resultan en un aumento en la expresión de MHC-I (Charni et al., 2010). Por otra parte se demostró que las células ¿0 consideradas como un caso extremo del efecto Warburg ya que carecen de cadena de transporte de electrones mitocondrial, presentan una disminución en la expresión de MHC-I (Charni et al., 2010). Otros trabajos publicados por el grupo de Garrido sostienen que células normalmente metastáticas que no expresan MHC-I son resistentes a la acción del sistema inmune, y acaban produciendo la muerte de los pacientes de cáncer (Garrido et al., 2010). Teniendo en cuenta la importancia de esta molécula para el reconocimiento y activación de las células efectoras del sistema inmune, se determinó si estas variaciones en la expresión del MHC-I afectan a la sensibilidad de las células tumorales a los linfocitos Tc o a las células NK. La inhibición de la respiración mitocondrial de las células ¿0 les confiere a estas células una disminución en el nivel de expresión de MHC-I que no afecta su sensibilidad a los linfocitos Tc pero sí aumenta su sensibilidad a células NK. En el caso opuesto, una estimulación de la respiración mitocondrial, conseguida incubando las células con DCA, provoca un aumento en la expresión de MHC-I que las hace más resistentes a las células NK. Como en el caso anterior, la variación en el nivel de MHC-I no afecta a su respuesta frente a linfocitos Tc. Las células L929dt, que carecen de expresión de MHC-I en superficie y que presentan una alta tasa de glucolisis aerobia, son resistentes a la acción de los linfocitos Tc. Sin embargo, el tratamiento con DCA restaura unos niveles bajos de MHC-I, pero suficientes como para aumentar su sensibilidad a los linfocitos Tc.