Perfil metabolómico de los preembriones humanos como potencial marcador no invasivo de aneuploidías

Resum

INTRODUCCIÓN En reproducción humana, uno de los campos en los que se han realizado, y se siguen realizando numerosos estudios, es el de la SELECCIÓN EMBRIONARIA. Es decir, encontrar la manera para escoger los mejores embriones a transferir, entendiendo como los mejores embriones no solamente aquellos que dan lugar a un embarazo sino también recién nacido sano en casa. Hasta el momento, dicha selección se ha realizado siguiendo parámetros morfológicos (método no invasivo) en todas nuestras pacientes. Adicionalmente, esta selección también se realiza mediante el análisis génico o cromosómico de los embriones que nos permite el diagnóstico preimplantatorio (DPI), método invasivo debido a la biopsia, y por lo tanto pérdida, de uno o dos de sus células. El hecho de poder desarrollar un nuevo método no invasivo para determinar embriones sanos y anómalos, complementario a los parámetros morfológicos y contrastado con el análisis cromosómico debería aumentar las probabilidades a la hora de escoger el embrión con mayor poder implantatorio. Las últimas investigaciones en las técnicas moleculares están definiendo perfiles génicos, proteicos y metabolómicos para intentar detectar cuál es el embrión más hábil, entendiendo esta habilidad como su capacidad para implantar. Actualmente las investigaciones están focalizadas en identificar proteínas y metabolitos. Esto nos ayudará a determinar la función celular durante el desarrollo embrionario humano y desarrollar nuevos marcadores de viabilidad para seleccionar los embriones a transferir. OBJETIVOS OBJETIVO PRINCIPAL Desarrollar un método no invasivo para detección de aneuploidías en embriones procedentes de FIV mediante el análisis metabolómico de los medios de cultivo (MC)antes de la transferencia embrionaria. OBJETIVOS SECUNDARIOS Analizar de forma global el metaboloma del embrión en día 3 y en día 5 de desarrollo. Identificación de biomarcadores asociados a normalidad/anormalidad cromosómica. Búsqueda de biomarcadoresmetabolómicos correspondientes a embriones con alteraciones del cromosoma 21 mediante UPLC-MS. Búsqueda de biomarcadoresmetabolómicos correspondientes a embriones con alteraciones del cromosoma 21 mediante RMN. MATERIAL Y MÉTODOS La población de estudio son los medios condicionados (MC) donde se han desarrollado los embriones de pacientes con indicación de DGP mediante FISH de 9 sondas (13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X e Y) para el Screening de Aneuploidías. En D3: Se realiza Biopsia embrionaria FISH y se congelan 50 µl de medio condicionado para estudio metabolómico En D5: Se realiza Transfer embrionario y se congelan 50 µl de medio condicionado para estudio metabolómico Posteriormente se practica el análisis metabolómico del medio de cultivo mediante Espectrometría de Masas o Espectroscopia por Resonancia Magnética Nuclear. RESULTADOS PRIMER ESTUDIO. Objetivo: Discriminar diferencias metabolómicas entre embriones normales y embriones con una alteración cromosómica mediante el análisis del metaboloma global del medio de cultivo por UPLC-MS. Resultados: Existe discriminación metabolómica entre embriones con alteraciones cromosómicas únicas y embriones normales SEGUNDO ESTUDIO. Objetivo: Discriminar diferencias metabolómicas entre embriones normales y embriones con múltiples anomalías cromosómicas mediante el análisis del metaboloma global del medio de cultivo por UPLC-MS. Resultados: Cuanta más alteración cromosómica, más separación metabólica entre muestras normales y anormales. Se constata ausencia de marcadores universales. TERCER ESTUDIO: Objetivo: Reproducibilidad de los resultados con MC procedentes de distintos laboratorios. Resultados: Podemos ampliar nuestras muestras de estudio a varios laboratorios de FIV puesto que los resultados obtenidos son reproducibles. CUARTO ESTUDIO: Objetivo: La ausencia de marcadores universales nos hace focalizar en alteraciones cromosómicas específicas, iniciando el estudio del cromosoma 21. Resultados: Marcadores metabolómicos de trisomía 21 permiten discriminar entre embriones normales y embriones con Síndrome de Down. QUINTO ESTUDIO: Objetivo: Reproducibilidad de los marcadores obtenidos mediante la espectroscopia por resonancia magnética nuclear (RMN). Identificar nuevos biomarcadores de alteraciones en el cromosoma 21 mediante el análisis por RMN. Resultados: No coincidencia de los marcadores metabólicos obtenidos mediante EM. Diferencia significativas en los niveles de Leucina / Isoleucina entre embriones afectos de Monosomía 21 y Trisomía 21. CONCLUSIONES: 1. El perfil metabolómico global de embriones cromosómicamente normales es distinto al de embriones anormales, siendo estas diferencias más claras en embriones de día 3 que en día 5 de desarrollo, y más evidente aún en aquellos caóticos con mayor cantidad de anomalías cromosómicas. 2. No hemos podido encontrar la presencia de biomarcadores metabolómicos entre ambos grupos que nos diferencien embriones sanos y afectos, sino sólo diferencias cuantitativas de determinados biomarcadores. 3. Mediante UPLC-MS, hemos encontrado biomarcadores metabolómicos estadísticamente diferenciales entre embriones normales y aquellos con trisomía 21. Dos de ellos son metabolitos conocidos como el caproato y sulfato de androsterona, los otros dos metabolitos son desconocidos, el X-15622 y el X-14808. 4. Mediante RMN, hemos descubierto biomarcadores metabolómicos diferenciales entre embriones afectos de trisomía 21 y embriones afectos de monosomía 21. La comparación de los espectros entre los distintos grupos revela diferencias en las regiones correspondientes a Leucina/Isoleucina.