Identificación y estudio de grandes reordenamientos en los genes brca1 y brca2 en familias con cáncer de mama y/o cáncer de ovario hereditario

Resumen

RESÚMEN DEL PROYECTO DE TESIS: Introducción El cáncer de mama (CM) es la neoplasia maligna más común entre las mujeres de los países desarrollados1. Se estima que entre el 5-10% de todos los CM y/o cánceres de ovario (CO) son de causa genética2,3. Aunque no se conocen todos los genes responsables del CM y/o CO hereditario (CMOH), los estudios epidemiológicos proporcionan una evidencia clara de que son dos los genes que confieren una mayor susceptibilidad dominante: BRCA1 (17q21)4,5 (MIM # 113705) y BRCA2 (13q12-13)6,7 (MIM # 600185). Las mutaciones puntuales en la línea germinal de los genes BRCAs (BRCA1 y BRCA2) deberían explicar la mayoría de los casos de CM y/o CO hereditario (CMOH). Sin embargo, la incidencia de mutaciones patogénicas observada en las diversas poblaciones estudiadas es considerablemente más baja (15-20%)8 que la estimada por los análisis de ligamiento (84%)9. Estos datos sugieren que una fracción sustancial de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 puede presentarse en regiones no exploradas, tales como la región del promotor o regiones no traducidas (UTRs y secuencias intrónicas), y pasan desapercibidas a los procedimientos de rutina habituales empleados para la detección de alteraciones moleculares en los genes BRCAs10,11. Consecuentemente, en la última década diversos estudios han confirmado la existencia de otro tipo de alteración molecular en los genes BRCA1 y BRCA2, los denominados grandes reordenamientos genómicos (Large genomic rearrangements, LGRs)12,13. La detección de LGRs en los genes BRCA1 y BRCA2 ha contribuido a incrementar la proporción de casos de CMOH. Sin embargo, los diversos estudios realizados hasta el momento señalan una prevalencia de LGRs muy variada, dependiendo principalmente de la población y de las características de las familias estudiadas10. Además, no existe ningún meta-análisis que estime la proporción global de los LGRs y valore la heterogeneidad de los estudios realizados. Por ello, resulta necesario estimar la proporción y diversidad de los LGRs en las familias de alto riesgo de CMOH de la Comunidad Valenciana; precisar su contribución a la patología molecular del CMOH; profundizar en los mecanismos moleculares para mejorar nuestra compresión sobre la etiopatogénesis tumoral; y, definir los criterios de selección necesarios para su estudio. Objetivos 1. Identificación de LGRs en pacientes con fuerte historia familiar de CM y/o CO que hayan resultado negativos en el estudio de mutaciones puntuales en los genes BRCA1 y BRCA2. 2. Caracterización molecular genómica de los LGRs detectados y estudio de su repercusión en el ARNm y/o proteína. 3. Estimación del riesgo o predisposición al cáncer que confieren los LGRs. Análisis de la posible existencia de un fenotipo y penetrancia diferente entre las familias portadoras de LGRs y las que presentan mutaciones puntuales en los genes BRCA1 y BRCA2. 4. Valoración de la utilidad diagnóstica de los LGRs de los genes BRCA1 y BRCA2 en el manejo clínico del CMOH. Material y Métodos Sujetos de estudio: Proponemos un estudio de 612 familias de alto riesgo de CM y/o CO que han resultado negativas para el estudio de mutaciones puntuales en los genes BRCA1 y BRCA2, reclutadas durante los primeros años de funcionamiento del Plan Oncológico de la Comunidad Valenciana14 de acuerdo con los criterios establecidos en la Guía de Práctica Clínica en Cáncer Hereditario para el síndrome del CMOH15. Instrumentalización y determinaciones: » Extracción de ácidos nucleicos: El aislamiento de ADN y ARN se realizará con el empleo de los kits QIAamp DNA Mini Kit (#51304) y RNeasy Mini Kit (#74104) de Qiagen, respectivamente. » Identificación y estudio de LGRs: La detección de LGRs en los genes BRCA1 y BRCA2 se realizará mediante el método de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification" (MLPA) y Análisis de Fragmentos por electroforesis capilar. Para confirmar y caracterizar los LGRs identificados se utilizarán métodos moleculares alternativos, tales como Cuantificación Relativa mediante PCR en tiempo real (RQ-PCR), Transcripción Reversa-PCR (RT-PCR), Mapas de restricción enzimática, PCRs de gran tamaño (Long Template-PCR), hibridación genómica comparada sobre array de Oligonucleótidos (OaCGH) o secuenciación directa. » Correlaciones genotipo-fenotipo y estudios de penetrancia: Las variables cualitativas serán analizadas con test no paramétricos. Así, la presencia de LGRs y su asociación con las características clínico-biológicas se analizará mediante el test Chi-cuadrado de Pearson o el exacto de Fisher. Para las variables continuas (edad al diagnóstico) se harán primero estudios de normalidad (test Shapiro-Wilk) y se aplicarán test paramétricos (test de Student o ANOVA). En caso de que no siguieran distribución normal se empleará la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Para estudiar los eventos en el tiempo se utilizará el modelo estocástico de Kaplan-Meier, y en caso de realizar algún análisis multivariante se utilizará el modelo de regresión de Cox. Todos los tests serán de 2 colas y los valores de p inferior a 0.05 se considerarán como diferencia estadísticamente significativa. Los datos se analizarán con el programa estadístico SPSS versión 11.0. Bibliografía 1. Ferlay J, Bray F, Sankila R, Parkin DM. EUCAN: Cancer Incidence, Mortality and Prevalence in the European Union 1997, version 4.0. IARC CancerBase No. 4. Lyon, IARC Press, 1999 2. Rowell S, Newman B, Boyd J, King MC. Inherited predisposition to breast and ovarian cancer. Am J Hum Genet. 1994;55:861-865 (Review). 3. Easton D, Peto J: The contribution of inherited predisposition to cancer incidence. Cancer Surveys 1990, 9:395-416. 4. Hall JM, Lee MK, Newman B, Morrow JE, Anderson LA, Huey B, King MC (1990) Linkage of early onset familial breast cancer to chromosome 17q21. Science 250: 16841689 5. Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D, et al: A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene, BRCA1. Science 1994, 266:6671. This paper describes the cloning of the BRCA1 gene. 6. Wooster R, Bignell G, Lancaster J, et al: Identification of a breast cancer gene, BRCA2. Nature 1995, 378:789791. This paper describes the cloning of the BRCA2 gene. 7. Tavtigian SV, Simard J, Rommens J, Couch F, Shattuck-Eidens D, Neuhausen S, Merajver S, et al (1996) The complete BRCA2 gene and mutations in 13q-linked kindreds. 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Plan Oncológico de la Comunidad Valenciana. Generalitat Valenciana. Conselleria de Sanitat 2009.