Analisis cuantitativo de la eficacia reparadora medular de la glia olfativa y modificacion genetica para evitar su senescencia

Resumen

1. Antecedentes y estado actual del tema. El sistema nervioso periférico y el central de los mamíferos adultos no responden por igual a las lesiones. Mientras que los axones dañados son capaces de regenerar a través del ambiente permisivo del SNP, la naturaleza inhibitoria del SNC evita el crecimiento de los axones produciéndose una desconexión permanente de las neuronas lesionadas y sus dianas y una pérdida irreversible de todas las funciones mediadas por dichas neuronas. Una de las primeras iniciativas para intentar la reparación de lesiones en el sistema nervioso central, fue la propuesta de Cajal de que transferir células gliales de un área en la que los axones puedan regenerar, podría transferir dicha capacidad de regeneración a otras áreas en las que este fenómeno no fuera posible. En los últimos años, muchos grupos de científicos han centrado sus esfuerzos en encontrar la forma de evitar el ambiente no permisivo del sistema nervioso central y proporcionarles a los axones las condiciones apropiadas para su elongación tras una lesión. Así, se han ido probando en roedores, una gran variedad de estrategias reparadoras, que han conseguido una recuperación funcional parcial de los animales lesionados [1-9]. De entre todas estas técnicas, el trasplante de glía envolvente de bulbo olfatorio (OEG) ha resultado hasta ahora una de las más prometedoras. La OEG central presenta, múltiples características que le resultan útiles para promover la regeneración axonal ya que no sólo es fuente de numerosos factores tróficos [10, 11], si no que es capaz de neutralizar las señales inhibitorias para el crecimiento axonal presentes en el medio [12-14] y de migrar proporcionando un sustrato físico para la regeneración. Las habilidades de la OEG para reparar lesiones medulares han sido ampliamente demostradas utilizando distintos modelos experimentales de (revisado en [15] y [16]). Los experimentos de lesión en raíces dorsales de la Dra. Ramón, [17], fueron los primeros en demostrar que los trasplantes de OEG , no sólo promovían el crecimiento axonal, sino también la reentrada y elongación de los mismo por el SNC. Estos resultados fueron corroborados por otros grupos [18] que demostraron que estos axones realizaban conexiones funcionales con sus dianas. El uso de trasplante de OEG en fase aguda de lesiones medulares completas en rata adulta acabó por confirmar definitivamente la capacidad de este tipo celular para promover la regeneración axonal de larga distancia[19]. 2. Bibliografía más relevante. l. Bregman, B.S., Regeneration in the spinal cord. Curr Opin Neurobiol, 1998. 8(6): p. 800-7. 2. Reier, P.J., Cellular Transplantation Strategies for Spinal Cord Injury and Translational Neurobiology. Neurorx, 2004. 1(4): p. 424-451. 3. Tuszynski, M.H., et al., New strategies in neural repair. Prog Brain Res, 2002. 138: p. 401-9. 4. Horner, P.J., F.H. Gage, and 20518951, Regenerating the damaged central nervous system. Nature, 2000. 407(6807): p. 963-70. 5. Santos-Benito, F.F. and A. Ramon-Cueto, Olfactory ensheathing glia transplantation: a therapy to promote repair in the mammalian central nervous system. Anat Rec, 2003. 27lB(1): p. 77-85. 6. Geller, H.M. and J.W. Fawcett, Building a bridge: engineering spinal cord repair. Exp Neurol, 2002. 174(2): p. 125-36. 7. Lopez-vales, R., et al., Chronic transplantation of olfactory ensheathing cells promotes partial recovery after complete spinal cord transection in the rat. Glia, 2007. 55(3): p. 303-11. 8. Schwab, J.M., et al., Experimental strategies to promote spinal cord regeneration-- an integrative perspective. Prog Neurobiol, 2006. 78(2): p. 91-116. 9. Deumens, R., et al., Olfactory ensheathing cells, olfactory nerve fibroblasts and biomatrices to promote long-distance axon regrowth and functional recovery in the dorsally hemisected adult rat spinal cord. Exp Neurol, 2006. 200(1): p. 89-103. 10. Goldberg, D.L. and B.A. Barres, The relationship between neuronal survival and regeneration. Annu Rev Neurosci, 2000. 23: p. 579-612, ll. Ramon-Cueto, A. and 3. Avila, Olfactory ensheathing glia: properties and function. Brain Res Bull, 1998. 46(3): p. 175-87. 12. Franceschini, I.A. and S.C. Barnett, Low-affinity NGF-receptor and E-N-CAM expression define two types of olfactory nerve ensheathing cells that share a common lineage. Dev Biol, 1996. 173(1): p. 327-43. 13. Barnett, S.C, et al., Identification of a human olfactory ensheathing cell that can effect transplant-mediated remyelination of demyelinated CNS axons. Brain, 2000. 123(Pt 8)(1): p. 1581-8. 14. Doucette, R., immunohistochemical localization of laminin, fibronectin and collagen type IV in the nerve fiber layer of the olfactory bulb. Int 3 Dev Neurosci, 1996. 14(7-8): p. 945-59. 15. Ramon-Cueto, A., Olfactory ensheathing glia transplantation into the injured spinal cord. Prog Brain Res, 2000. 128: p. 265-72. 16. Mackay-Sim, A., Olfactory ensheathing cells and spinal cord repair. Keio 3 Med, 2005. 54(1): p. 8-14. 17. Ramon-Cueto, A. and M. Nieto-Sampedro, Regeneration into the spinal cord of transected dorsal root axons is promoted by ensheathing glia transplants. Exp Neurol, 1994. 127(2): p. 232-44. 18. Navarro, X., et al., Ensheathing glia transplants promote dorsal root regeneration and spinal reflex restitution after multiple lumbar rhizotomy. Ann Neurol, 1999. 45(2): p. 207-15. 19. Ramon-Cueto, A., et al., Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron, 2000. 25(2): p. 425-35. 3. Objetivos de la investigación. En general, el principal objetivo de esta tesis es ampliar los conocimientos sobre las propiedades de la OEG que la convierten en una terapia prometedora para su uso en lesión medular. En primer lugar, pretendemos modificar este tipo celular in vitro con el objetivo de aumentar su vida media útil en cultivo con lo que se favorecerla la disponibilidad de grandes cantidades de OEG tanto para posibles estudios subsiguientes de trasplante o caracterización molecular como para la creación de bancos de células. En segundo lugar, en la parte "in vivo" de esta tesis pretendemos conocer y cuantificar las capacidades regenerativas del trasplante de OEG en la fase aguda de una lesión medular concretando el tipo de haces que son capaces de regenerar en respuesta a dicho tratamiento. Por otro lado, nos planteamos estudiar en la zona de la lesión los cambios que se producen a consecuencia de la presencia de la OEG cuantificando las diferencias encontradas. Además, nos propusimos probar la eficacia de un método de estabilización vertebral que fue utilizado en nuestros animales operados con el objetivo de estudiar la conveniencia de la estabilización vertebral tras una lesión medular y de analizar las modificaciones en nuestro modelo de terapia celular, introducidas por dicha técnica. 4. Metodología, y plan de trabajo. Para alcanzar los objetivos planteados en este trabajo se emplearon diferentes técnicas en función de la fase abordada. En primer lugar, para cumplir el primer objetivo se llevaron a cabo los cultivos y subcultivos de la OEG de rata adulta que se siguieron en cultivo durante aproximadamente seis meses, así como la obtención del virus, la infección de la OEG con el mismo y técnicas inmunocitoquímicas para la detección de diversos marcadores. Esta etapa se prolongó durante los dos primeros años de la tesis. En segundo lugar, la parte in vivo de este trabajo, exigía el aprendizaje de las técnicas de cirugía tanto de lesión completa como incompleta. Para esta última, se realizó una estancia en el laboratorio del Dr. Müller en la Universidad de Dusseldorf, y luego se puso a punto la técnica en el laboratorio. Además, se utilizó la técnica de fijación con el cemento dental en los animales operados. Por otro lado, una vez lesionados los animales se requirieron técnicas de cuidados y rehabilitación, así como la puesta a punto de los múltiples test comportamentales que se llevaron a cabo en los distintos casos. Por último, para la obtención de datos histológicos de estos animales, se realizaron técnicas de trazado neuroanatómico tanto anteróqrado (con Biotindextranlisina) como retrógrado (con Peroxidasa). Una vez sacrificadas las ratas por perfusión, se extrajeron tanto la médula como el encéfalo para su procesado y corte con el criostato y el revelado de los trazadores. También se detectaron por técnicas inmunohistoquímicas la expresión de distintas moléculas implicadas en procesos de cicatrización o respuesta a lesión. Para la cuantificación de las imágenes obtenidas de las tinciones realizadas se utilizó el programa de análisis de imágenes Metamorph y para el análisis estadístico de los datos se utilizó el programa SPSS.