Análisis funcional del autoantígeno CENP-A en la organización estructural del centrómero de mamíferos

Résumé

El objetivo principal de este trabajo era profundizar en la función que desempeña el antígeno centromérico humano CENP-A, en el papel general del centrómero. Para ello se plantearon cinco objetivos puntuales a desarrollar: 1,- Generar anticuerpos monoespecíficos contra el antígeno centromérico humano CENP-A para su uso posterior en ensayos tanto in vivo como in vitro. 2,- Ensayos del papel de la proteína centromérica CENP-A durante distintas fases del ciclo celular mediante el análisis por microinyección celular de los anticuerpos específicos anti-CENP-A generados. 3,- Establecer un protocolo inicial de purificación del autoantígeno humano CENP-A a partir de células y/o tejidos humanos, para su empleo en ensayos funcionales. 4,- Realizar ensayos de inmunoprecipitación de cromatina a partir de extractos nucleares humanos y analizar los componentes (ácidos nucleicos y proteínas) centroméricos coinmunoprecipitados con CENP-A. 5,- Aislar, clonar y caracterizar el gen del autoantígeno CENP-A en el genoma de hámster, y comparar la homología con el de otras especies ya descritas. Se ha generado un anticuerpo específico frente a un péptido de la región aminoterminal de la proteína humana CENP-A. Dicho anticuerpo ha sido purificado en una columna de afinidad y posteriormente utilizado en ensayos de microinyección en células humanas (HeLa), los cuales han revelado el papel esencial de CENP-A para la formación del cinetocoro y la división de la célula. Posteriormente se ha establecido un protocolo de purificación de la proteína nativa a partir de extractos de placenta humana, mediante solubilización de cromatina, cromatografía de intercambio iónico y de afinidad. Asimismo, se ha llevado a cabo la inmunoprecipitación de complejos de cromatina centromérica con el mismo anticuerpo generado anteriormente. El análisis mediante secuenciación de los ADN inmunoprecipitados ha revelado que no presenta