Análisis de subpoblaciones de linfocitos B en sangre periférica y órganos linfoides para su aplicación en el ámbito clínico

Resumo

El Rituximab (Rx) es un anticuerpo monoclonal quimérico que se une al CD20 expresado en la superficie de los linfocitos B (LB). Aunque su principal aplicación es en el tratamiento de leucemias y linfomas B, en los últimos años ha dado muy buenos resultados en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, especialmente en aquellas donde el daño está mediado por autoanticuerpos. La hipótesis aceptada es que la intensa depleción de los LB producida por el Rx conlleva la eliminación de los LB autorreactivos, que se asocia a una reducción del título de autoanticuerpos y por tanto una mejoría clínica. Sin embargo, aunque su eficacia en general es significativa, existe una gran variabilidad en la respuesta de los pacientes, sin que podamos predecir cuál va a ser, ni cuándo se va a producir una recaída. Los principales trabajos que se ocupan de la monitorización post-Rx utilizan la citometría de flujo como herramienta para el análisis de las subpoblaciones B post-Rx y su correlación con la clínica del paciente. Pero la baja sensibilidad aplicada y la baja especificidad a la hora de definir el inmunofenotipo de las diferentes subpoblaciones hacen que exista una gran variabilidad en las conclusiones en cuanto al cómo, cuándo y qué tipo de células analizar. Es por ello que la repoblación B post-Rx no se monitoriza, decidiéndose empíricamente la pauta de administración del fármaco en función de criterios clínicos. Teniendo en cuenta el coste del Rx así como sus potenciales efectos secundarios, sería deseable contar con un sistema que objetivara el efecto del fármaco, para así ajustar mejor la dosis y la pauta terapéutica en cada paciente. Por ello creemos que, la aplicación de técnicas de citometría de flujo ultrasensible, junto con el estudio exhaustivo de subpoblaciones B en diferentes tejidos, permitirá detectar poblaciones mínimas en SP que permanecen indetectables con las técnicas utilizadas hasta el momento. Esto supondrá un avance significativo a la hora de monitorizar las características de la repoblación B post-Rituximab en enfermedades autoinmunes. Para ello desarrollamos un protocolo de citometría de alta sensibilidad, y definimos la combinación óptima de marcadores para el análisis de subpoblaciones B, analizando la diferenciación B completa desde la médula ósea hasta los órganos linfoides secundarios como ganglio, amígdala y bazo, además de la sangre periférica (SP). También se incluyó el análisis de calidad de las muestras de MO frecuentemente hemodiluidas en los estudios de citometría de flujo. Aplicando el protocolo de citometría de alta sensibilidad y el panel de marcadores definidos, estudiamos 72 muestras de SP post-Rx de 33 pacientes con enfermedades autoinmunes donde identificamos un patrón común de reconstitución B en el que definimos 4 etapas sucesivas; fase de depleción, inicio de reconstitución, repoblación precoz y repoblación tardía. Demostramos que una clasificación por etapas basada en la distribución de subpoblaciones ilustra mejor la realidad funcional del compartimento B, mejor que el tiempo post-Rx y mejor que la cantidad total de LB. Con ello pudimos definir las características para una correcta monitorización por citometría post-Rx en pacientes con enfermedades autoinmunes: Primero, el panel de marcadores debe permitir la identificación fiable de LB memoria CD27+ que han realizado cambio de isotipo, junto a la de plasmablastos, ambas relacionadas con la clínica de la enfermedad, por lo que debe incluir los marcadores CD19, CD38, CD24, CD27, IgM e IgD, además del marcador de exclusión CD3. Segundo, el análisis debe realizarse en la etapa de depleción, en torno a los 6 meses tras el tratamiento, antes de que se inicie la reconstitución B ya que puede enmascarar los resultados. Finalmente, se requiere de la adquisición de un mínimo de 3 millones de leucocitos para alcanzar un límite de sensibilidad suficiente de 10-5, ya que los LB son una población residual tras el tratamiento con Rx.