Design and evaluation of non-viral vectors based on solid lipid nanoparticles for the treatment of x-linked juvenile retinoschisis by gene therapy

Zusammenfassung

La retinosquisis juvenil ligada al cromosoma X (XLRS) es una enfermedad degenerativa de la retina que afecta a entre 1/5,000 y 1/25,000 individuos en el mundo. Se debe a la mutación del gen RS1, que codifica la proteína retinosquisina. La ausencia de esta proteína produce la separación de las capas de la retina y la formación de quistes intrarretinianos, que finalmente conducen a la ceguera de los pacientes, no existiendo actualmente tratamiento ni curativo ni preventivo para esta enfermedad. Al ser una enfermedad monogénica recesiva, es una excelente candidata para la terapia génica. Hasta ahora los estudios que se han publicado sobre la aplicación de terapia génica en el tratamiento de la XLRS han sido con vectores virales. Debido a los problemas de este tipo de vectores desde el punto de vista de la seguridad, los vectores no virales constituyen una estrategia muy prometedora.Dentro de los vectores no virales, las nanopartículas sólidas lipídicas (SLNs) presentan grandes ventajas, ya que han demostrado capacidad de transfección de tejidos oculares y están constituidas por materiales biocompatibles y biodegradables, se pueden producir a nivel industrial a menor coste que los vectores virales, y se pueden someter a procedimientos de liofilización para prolongar su estabilidad durante el almacenamiento.Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, el objetivo de esta tesis ha sido el diseño y evaluación de vectores no virales basados en nanopartículas lipídicas para el tratamiento de la XLRS mediante terapia génica.En un estudio previo se preparó un vector con SLNs, protamina y dextrano (DX) que fue capaz de transfectar la retina tras su administración ocular a ratas. Como primer objetivo de esta tesis, se procedió a modificar la formulación substituyendo el DX por ácido hialurónico (HA), cuyos beneficios para terapia génica son conocidos. Se diseñaron varias formulaciones con HA de diferente peso molecular (150, 500 y 1500 kDa) y con diferente proporción HA:ADN. Estudios en células HEK-293 y ARPE-19, dos líneas celulares con diferente capacidad de división celular, mostraron la alta eficacia de transfección de los vectores, no detectándose diferencias dependiendo del tamaño molecular del HA. Además, los vectores presentaron una alta capacidad de internalización celular. Se estudiaron los mecanismos de endocitosis, comprobándose que en células ARPE-19, los vectores son captados tanto por endocitosis mediada por clatrinas como por endocitosis mediada por caveolas; además, en el proceso de internalización también interviene el receptor CD44, que explica la capacidad del HA de unirse a este receptor. En células HEK-293, los vectores entran fundamentalmente por endocitosis mediada por caveolas. Así, en células ARPE-19, la liberación del ADN a nivel intracelular, paso previo para su entrada en el núcleo para poder desencadenar el proceso de transfección, está condicionada por la actividadlisosomal derivada de la fusión del endosoma con los lisosomas cuando la endocitosis está mediada por clatrinas. Sin embargo, en células HEK-293, donde los vectores entran por vía caveolas, que evita la acción lisosomal, la transfección está condicionada por la capacidad de liberación del ADN a nivel intracelular. En este sentido, el HA es capaz de modular el alto grado de condensación del ADN en el vector debido a la protamina, favoreciendo su liberación, y por tanto la transfección. Una vez caracterizado, se comprobó que el vector era capaz de transfectar células ARPE-19 y producir la proteína terapéutica retinosquisina.Aunque se han obtenido resultados prometedores en estudios con modelos animales en los que se aplicaba terapia génica para el tratamiento de la XLRS, siempre se han utilizado vectores virales. Debido a la limitación de este tipo de vectores, fundamentalmente desde el punto de vista de la seguridad, y a los resultados obtenidos in vitro con nuestros vectores, se procedió a la evaluación tanto del vector preparado con HA como del vector preparado con DX en ratones normales y en ratones deficientes en el gen RS1, modelo animal de la XLRS. Los dos vectores se administraron por vía intravítrea y por vía subretiniana.Una vez el vector elaborado con HA fue optimizado y caracterizado se procedió a su evaluación en ratones tras su administración intravítrea y subretiniana. Para ello, se prepararon los vectores con el plásmido que contenía el gen RS1y el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) bajo la acción de un promotor inespecífico. La expresión de GFP, al ser una proteína intracelular, nos permite conocer en qué células de la retina se produce la transfección, y la expresión de retinosquisina, al ser una proteína secretada, nos permite estudiar su localización tras el proceso de transfección y secreción.Una semana después de la administración de los vectores a ratones normales por vía intravítrea y subretiniana, se detectó la GFP en todos los animales tratados y en casi todas la capas de la retina, incluyendo células de epitelio pigmentario y fotorreceptores. Con la administración subretiniana, se transfectaron principalmente células del epitelio y fotorreceptores, aunque con la formulación de HA también se obtuvo una alta expresión en células ganglionares. Tras la administración intravítrea, se transfectaron principalmente células ganglionares. Estos resultados indican la capacidad de los vectores de proteger y liberar el gen y hacer que se exprese en diferentes capas de la retina. Además, se puso de manifiesto su capacidad para difundir desde el lugar de inyección a través de la retina, especialmente con el vector HA-SLN.Se procedió a continuación a administrar los vectores a ratones deficientes en el gen RS1. Dos semanas después de la inyección, se detectó la retinosquisina en todas las capas de la retina, excepto en la capa ONL. En general, la administración subretiniana proporcionó un mayor nivel de expresión que la inyección intravítrea, no encontrándose diferencias entre los dos vectores. Esto podría ser debido a que la difusión de ambos vectores está favorecida por la desorganización de la retina como consecuencia del defecto genético, y no tanto por la composición del vector. El análisis estructural de la retina de los ratones reveló que en los ojos tratados había una menor pérdida de fotorreceptores, una disminución de quistes y una mejora de la organización de la retina con respecto a los ratones no tratados. Además, se incrementó el grosor de la retina. Dos meses después de la administración subretiniana, se detectó una menor expresión de retinosquisina que a las dos semanas, y el efecto reparador de la retina también fue menor.Ya que en un estudio previo se sugirió que aunque la retinosquisina se puede sintetizar en diferentes tipos de células, su actividad es mayor cuando se sintetiza en los fotorreceptores. Por ello, para incrementar laResumen3transfección en fotorreceptores, se prepararon los vectores con el gen RS1 bajo el control del promotor mOPS, que presenta una alta actividad en estas células y se procedió a su evaluación tras su inyección intravítrea en ratones deficientes en el gen RS1. El análisis de la proteína GFP demostró una mayor transfección con el vector HA-SLN en fotorreceptores que con el vector DX-SLN. Sin embargo no se encontraron diferencias en los niveles de retinosquisina entre los dos vectores. Los mayores niveles de retinosquisina se detectaron en fotorreceptores, en la capa INL y en células ganglionares. Hay que tener en cuenta que esta proteína es secretada por la célula una vez sintetizada, por lo que su detección en una determinada capa celular no significa que sea en esa capa donde se haya sintetizado. El análisis estructural de la retina mostró una mejoría en cuanto a la organización de la retina, pérdida de fotorreceptores y presencia de quistes. Además, aumentó el grosor de la retina y de la capa ONL, además con el vector HA-SLN, se alcanzaron los niveles de los ratones sanos. El mayor efecto del vector HA-SLN sobre la recuperación de la retina se asocia a una mayor formación de la retinosquisina en fotorreceptores con este vector.En conclusión, este trabajo ha demostrado en ratones deficientes en el gen RS1 la capacidad de vectores no virales basados en nanopartículas sólidas lipídicas para restaurar la estructura de la retina. A pesar de los prometedores resultados, son necesarios estudios adicionales para comprobar el efecto a más largo plazo y si la recuperación de la retina implica una mejoría en la función visual.