Molecular mechanisms regulating Schwann cell myelination during development and in pathological conditions

Resumen

Las células de Schwann son las células gliales dominantes del sistemanervioso periférico (SNP) que se asocian con los axones en los troncos nerviososperiféricos. Estas células controlan la supervivencia neuronal en el embrión, forman lavaina de mielina que es esencial para el movimiento y la sensación normal en el adultoy controlan la regeneración y reparación en los nervios dañados. Las células deSchwann maduras que se encuentran en los nervios periféricos adultos se originan apartir de células de la cresta neural multipotentes, a través de diferentes estadíostransitorios. Inicialmente, las células de la cresta neural dan lugar a las células deSchwann precursoras, que posteriormente generan las células de Schwanninmaduras. En el nacimiento, las células de Schwann inmaduras se diferencian encélulas de Schwann mielinizantes o en células de Schwann no mielinizantes. Ladiferenciación de las células de Schwann inmaduras en células de Schwannmielinizantes está precedida por el ¿radial sorting¿. Durante este proceso, las célulasde Schwann inmaduras, migran a lo largo de los axones, envían procesosRESUMEN TESIS DOCTORAL MARTA IRUARRIZAGA LEJARRETA2citoplasmáticos entre los grupos de axones y progresivamente los van desfasciculandohasta que establecen una relación 1:1 con ellos. El proceso de mielinización se hadesarrollado para facilitar una conducción rápida y saltatoria de los impulsos nerviososa lo largo de axones de diámetro grande (>1¿m). Una característica llamativa de lascélulas de Schwann es su plasticidad. En respuesta a una lesión en el nervio, lascélulas de Schwann maduras son capaces de transdiferenciarse y adoptar un fenotiposimilar al de las células de Schwann inmaduras en un proceso llamado degeneraciónWalleriana.La mielinización es un proceso estrictamente regulado y caracterizado porcambios globales en la expresión génica. En primer lugar, en este estudio hemosanalizado el papel de la metilación del ADN, una modificación epigenética esencialpara el desarrollo de los mamíferos, durante el proceso de mielinización. Durante lametilación del ADN, el grupo metilo se transfiere desde la S-adenosilmetionina(SAMe), principal donante biológico de grupos metilo, a residuos citosina, en unareacción catalizada por las metiltransferasas de ADN. Concretamente, la enzimaglicina N-metiltransferasa (Gnmt) cataliza la reacción de transmetilación en la queSAMe dona el grupo metilo a la glicina para producir sarcosina y Sadenosilhomocisteína(SAH) y realiza una función clave porque mantiene el ratioSAMe/SAH constante. Este ratio se considera un índice importante para determinar elestado de metilación de las células.Inicialmente, utilizamos la técnica de bisulfito de representación reducida desecuenciación (reduced representation bisulfite sequencing o RRBS) para examinar ladinámica del metiloma durante el proceso de mielinización de las células de Schwannin vivo, en nervios ciáticos extraídos de ratones de diferentes edades que secorresponden con las etapas más relevantes del proceso de mielinización. Estosincluyen nervios de ratones recién nacidos (contienen fundamentalmente células deSchwann inmaduras), nervios de ratones de 10 días (contienen una poblaciónenriquecida de células de Schwann activamente mielinizantes) y nervios de ratones de60 días (contienen células de Schwann mielinizantes maduras). Encontramos que elproceso de mielinización de las células de Schwann se caracteriza por unadesmetilación del ADN global, que se correlaciona con un aumento en la expresión degenes esenciales para el proceso de mielinización, y mas en particular, con unaumento en la expresión de genes involucrados en la biosíntesis de lípidos,RESUMEN TESIS DOCTORAL MARTA IRUARRIZAGA LEJARRETA3componentes esenciales de las vainas de mielina. Nuestras observaciones apoyan lanoción de que los niveles de S-adenosilmetionina (SAMe) tienen un papel fundamentalen la regulación de la metilación en las células de Schwann mielinizantes. Eltratamiento exógeno de SAMe bloquea la mielinización in vitro y los nervios periféricosde ratones Gnmt -/-, un modelo in vivo de niveles elevados de SAMe, están claramentehipomielinizados. El análisis por RRBS reveló una hipermetilación del ADN global yespecífica del locus en nervios Gnmt-/-. Específicamente, la hipermetilación seencontró en regiones promotoras y potenciadoras de varios genes implicados en lasíntesis de lípidos. Esto a su vez da lugar a un perfil lipídico alterado que podríacontribuir a los defectos en las vainas de mielina observados en estos ratones.También realizamos RRBS en nervios extraídos de ratones db/db, un modelo de ratónde neuropatía diabética, y encontramos niveles reducidos de SAMe quecorrelacionaban con una hipometilación del ADN y con una alteración de la expresióngénica en estos ratones.En definitiva, utilizando mapas del metiloma de alta resolución, mostramos quela metilación del ADN podría jugar un papel regulador clave en el proceso demielinización del sistema nervioso periférico y que SAMe regula la dinámica delmetiloma durante este proceso. Nuestro trabajo también sugiere un posible papel deSAMe en el establecimiento de patrones de metilación de ADN aberrantes en ratonesdb/db,, implicando a SAMe en la patogénesis de la neuropatía diabética. Estasobservaciones críticas establecen una conexión entre SAMe y la metilación del ADNen un sistema biológico definido, proporcionando un mecanismo que podría dirigir loscambios en la metilación durante la diferenciación de las células de Schwann y endiversas situaciones patológicas.Los cambios coordinados en la expresión génica asociados con el proceso demielinización de las células de Schwann están controlados transcripcionalmente poruna red elaborada de factores de transcripción, por el reclutamiento de complejos deremodelación de la cromatina a regiones reguladoras de genes clave para lamielinización y posiblemente por la desacetilación de histonas. Además, losmicroARNs y las proteínas de unión al ARN juegan un papel crucial en la regulaciónpost-transcripcional de estos cambios globales en la expresión génica. Por esta razón,en segundo lugar, hemos examinado el papel de la regulación post-transcripcional deRESUMEN TESIS DOCTORAL MARTA IRUARRIZAGA LEJARRETA4la expresión génica ejercida por la proteína de unión al ARN HuR durante el procesode mielinización de las células de Schwann.HuR ejerce un papel fundamental en la regulación post-transcripcional de laexpresión génica en las células de mamíferos, controlando numerosos procesosbiológicos. Esta proteína reconoce y se une a elementos adenilato/uridilato (AREs) enla región no traducida 3¿ (3¿ UTR) y 5¿ (5¿ UTR) de sus ARN mensajeros (ARNm)diana en el núcleo. En respuesta a un estímulo, HuR se transloca al citosol junto consus ARNm, donde generalmente promueve la estabilidad de dichos ARNm y/o latraducción de los mismos a proteína. Después de realizar su función estabilizadora,HuR se libera de sus ARNm diana y se transloca de nuevo al núcleo.En este estudio, observamos que HuR está altamente expresado en las célulasde Schwann inmaduras, en las que regula coordinadamente la expresión de variosgenes para promover la proliferación, apoptosis y morfogénesis, en respuesta a laNRG1, TGFß y lamininas, tres señales fundamentales implicadas en el proceso de¿radial sorting¿. Estas funciones de HuR correlacionan con su abundancia y sulocalización subcelular, que se regulan por diferentes vías de señalización en lascélulas de Schwann. Específicamente, demostramos que p38 kinasa induce latranslocación de HuR al citosol para promover la morfogénesis y la motilidad enrespuesta a la laminina, que ERK y AKT y ERK y p38 kinasa están implicadas en latranslocación de HuR al citosol para promover la proliferación en respuesta a la NRG1y a TGFß, respectivamente y que p38 kinasa induce la translocacion de HuR al citosolpara promover la apoptosis. Sorprendentemente, HuR también se une a varios ARNmque codifican para proteínas relacionadas con la mielinización, pero en este caso y alcontrario de su función típica, regula negativamente sus expresiones, posiblementepara prevenir una mielinización ectópica durante el desarrollo.Además, identificamos a la NRG1 y a TGFß como dos señales que favorecenel reclutamiento al promotor de HuR de p65 y Smad2/3, respectivamente, aumentandoasí la transcripción de HuR. También demostramos que Krox-20, el regulador maestrode la mielinización, está implicado en la regulación de los niveles de HuR. Krox-20induce la degradación proteosómica de HuR, y por tanto, disminuye sus niveles.Las células de Schwann también son las células patógenas cruciales en laNeurofibromatosis tipo 1 (NF1), un desorden autosómico dominante que se caracterizaRESUMEN TESIS DOCTORAL MARTA IRUARRIZAGA LEJARRETA5por la aparición de tumores benignos (neurofibromas dermales y plexiformes) en lavaina de los nervios periféricos. Se estima que aproximadamente el 10% de losneurofibromas plexiformes sufren una transformación maligna y se convierten entumores malignos de la vaina del nervio periférico (TMVNP), que son sarcomas detejido blando altamente metastáticos y esencialmente incurables. Estudios previos handemostrado que HuR se expresa de manera aberrante en diferentes tipos de cáncer,en los que regula la expresión de varias proteínas relacionadas con procesosoncogénicos. Además, se ha encontrado una fuerte correlación entre la expresión deHuR y estadíos de malignidad avanzados. Por ello, en tercer lugar, hemos examinadoel papel de HuR en neurofibromas (NF) y en tumores malignos de la vaina del nervioperiférico (TMVNP). De manera similar a lo que ocurre en otros tipos de cánceres,observamos que HuR está altamente expresada en NFs y TMVNPs, en los quecontrola rasgos clave del cáncer, incluyendo proliferación, apoptosis y migración,regulando varios ARNm con funciones bien definidas en oncogénesis. Además,utilizando la técnica RIP-CHIP, encontramos que el número de ARNm diana unidos aHuR aumentaba con la malignidad de los tumores, y mostramos que el silenciamientode HuR previene la formación de tumores in vivo en modelos de xenoinjertos. Con elfin de determinar los mecanismos que contribuyen a mantener unos niveles elevadosde HuR en TMVNPs, analizamos los niveles de expresión de varios microRNAs enmuestras humanas que corresponden a diferentes estadios de malignidad por qPCR.Los microRNAs cuya expresión estaba disminuída en los TMVNPs en comparacióncon los neurofibromas se utilzaron para predecir computacionalmente si se asociabana HuR. Identificamos a miR-146a y a miR-342 como reguladores negativos de HuR, yaque sus sobreexpresiones in vitro, en células derivadas de TMVNPs, reducían losniveles de HuR de manera significativa.En base a los resultados obtenidos, proponemos que HuR desempeña unafunción reguladora de genes clave en el desarrollo de NFs y TMVNPs y que podría serconsiderada una diana terapeútica interesante para tratar este tipo de tumores.Un requisito fundamental para la regeneración del sistema nervioso periféricoes la rápida degradación de la mielina por las células de Schwann y los macrófagos.Sin embargo, todavía no se han identificado los mecanismos intrínsicos que median ladegradación de la mielina en las células de Schwann. Por lo tanto, en último lugar,hemos examinado los mecanismos que median la degradación de la mielina enrespuesta a la lesión del nervio periférico. En este estudio, proponemos que laRESUMEN TESIS DOCTORAL MARTA IRUARRIZAGA LEJARRETA6degradación de la mielina por las células de Schwann podría estar mediada por laautofagia, un sistema de degradación para macromoléculas y orgánulos que dependedel lisosoma. Observamos que hay un aumento significativo de la expresión de genesy proteínas relacionadas con la autofagia después de la lesión del nervio periférico, yque la inactivación genética de la autofagia conduce a un bloqueo en la digestión deproteínas y lípidos asociados a la mielina durante el proceso de desmielinización.En conclusión, proponemos la regulación de la expresión génica por metilacióndel ADN y la proteína de unión de ARN HuR como nuevos mecanismos implicados enel desarrollo de células de Schwann y en el proceso de mielinización. Tambiénsugerimos que la desregulación de estos dos mecanismos podría contribuir a lapatogénesis de la neuropatía diabética y la neurofibromatosis tipo 1, respectivamente.Además, describimos la autofagia como un nuevo mecanismo involucrado en ladegradación de la mielina por las células de Schwann después de la lesión del nervioperiférico.