Estudio del potencial probiótico de lactobacillus plantarum C4

Abstract

Los probióticos se definen como “microorganismos vivos que, cuando son administrados en adecuadas cantidades, confieren beneficios para la salud del huésped” (OMS, 2001). Actualmente existe un gran interés científico y comercial en el uso de microrganismos beneficiosos para la prevención y tratamiento de enfermedades. Entre los efectos beneficiosos de los microorganismos probióticos se mencionan los siguientes: disminución de la duración y la gravedad de la diarrea viral y la diarrea asociada a antibióticos, mejora de la digestión de la lactosa, disminución de la hipercolesterolemia, prevención de la inflamación intestinal especialmente en la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa, actividad preventiva de afecciones alérgicas, especialmente en la urticaria, reducción de la colonización por Candida en infecciones vaginales, protección de la mucosa intestinal al contrarrestar los efectos de las sustancias genotóxicas y mutagénicas en el colon producto de la dieta o del metabolismo microbiano (Binns, 2013). La investigación sobre lactobacilos probióticos es una de las líneas de investigación más recientes del Grupo de Inmunología Microbiana (BIO 201) de la Universidad de Granada, cuyo investigador principal es el Prof. Alfonso Ruiz-Bravo. Tras un muestreo de nuevas cepas probióticas, la atención del Grupo se centró en la cepa C4 de L. plantarum aislada de un kéfir comercial. Recientes investigaciones han demostrado que esta cepa cumple los criterios de bacterias potencialmente probióticas, ya que resiste el pH ácido y la bilis y posee propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras. Además, se ha observado que la leche desnatada tiene capacidad como tampón y es un vehículo apropiado para la administración intragástrica de L. plantarum C4 en ratones (Bujalance et al., 2007). Fuentes et al. (2008a) analizaron muestras de ratones alimentados con L. plantarum C4 bajo diferentes condiciones inmunológicas; sus resultados mostraron la presencia del probiótico en el intestino y una expansión de bacterias filamentosas en el íleon de los ratones inmunodeficientes, que no se observó tras la administración de L. plantarum C4. Además, el mismo grupo de investigación observó un incremento de lactobacilos en heces y muestras de intestino de ratones tras recibir una mezcla de L. plantarum C4 y L. casei (Fuentes et al., 2008b). Puertollano et al. (2008) observaron que la administración oral de L. plantarum C4 redujo la producción de interleukinas proinflamatorias en ratones infectados con Listeria monocytogenes, especulando que esta cepa podría ejercer efectos antiinflamatorios; más tarde, se llevó a cabo el primer estudio in vitro sobre actividad antimicrobiana y biológica de sobrenadantes concentrados de L. plantarum, observando que L. plantarum C4 libera un compuesto responsable de la ruptura de la membrana plasmática de E. coli y de una actividad citotóxica en células promielocíticas de leucemia humana (Puertollano et al., 2009). Posteriormente se comprobó que los sobrenadantes de L. plantarum C4 son capaces de inducir necrosis en lugar de apoptosis a dosis altas en la línea celular promielocítica, demostrando las propiedades citotóxicas de los mismos en esta línea celular tumoral y abriendo la posibilidad de analizar la composición química para elucidar las moléculas bioactivas (Puertollano et al., 2013). La presente memoria de Tesis Doctoral ha sido estructurada en capítulos en los que se incluye: (1) el estudio de la viabilidad de la cepa C4 en condiciones de digestión gastrointestinal, la influencia del prebiótico Fructooligosacárido FOS e interacciones con bacterias patógenas intestinales, (2) evaluación de la neutralización de las toxinas de Clostridium difficile por la cepa C4, (3) la evaluación de la actividad antimutagénica de la cepa C4 sobre agentes mutagénicos y (4) la evaluación de la actividad inmunomoduladora in vitro e in vivo. El trabajo recogido aporta nuevos conocimientos sobre las propiedades probióticas de Lactobacillus plantarum C4. Estos conocimientos se extienden al comportamiento de la bacteria en las condiciones de digestión gastrointestinal, sinergia con el fructooligosacárido FOS, interacciones de antibiosis con diversos patógenos intestinales, inactivación de citotoxinas de Clostridium difficile, actividad antimutágena, inmunomodulación in vitro e in vivo y resistencia a la infección experimental por Yersinia enterocolitica. A continuación se presentan las conclusiones concretas derivadas de este estudio: 1ª. Lactobacillus plantarum C4 resiste las condiciones de una simulación in vitro de la digestión gastrointestinal, mostrando al final del proceso un crecimiento moderado. 2ª. La adición de fructooligosacárido prebiótico (FOS) al medio en distintas condiciones experimentales, incluyendo medios de cultivo ricos y mínimos y un proceso de digestión gastrointestinal de leche descremada, no puede sustituir a la dextrosa como sustrato para el crecimiento de Lactobacillus plantarum C4, pero prolonga su viabilidad. 3ª. En el curso de un proceso de digestión gastrointestinal de vehículo lácteo adicionado de FOS, Lactobacillus plantarum ejerce un efecto inhibidor sobre cepas de las bacterias patógenas intestinales Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium y Enterococcus faecalis, siendo la presencia de FOS un requisito necesario para esta inhibición al menos en el caso de Y. enterocolitica. 4ª. La producción de ácidos por Lactobacillus plantarum C4 inactiva la toxicidad de los sobrenadantes de Clostridium difficile toxigénico, siendo el factor determinante de esta inactivación el pH y no la naturaleza de los ácidos. 5ª. La cepa C4 de Lactobacillus plantarum ejerce antibiosis in vitro sobre Clostridium difficile, sin que la presencia o ausencia de los genes responsables de la toxigenicidad influya en este efecto. 6ª. Lactobacillus plantarum C4 inhibe de forma significativa la mutagenicidad del 2-nitrofluoreno sobre la cepa auxotrofa S. typhimurium TA98 en el ensayo de Ames, en condiciones en las que la viabilidad de C4 se ve abolida, lo que sugiere un mecanismo de adsorción que faculta a esta bacteria para retirar el mutágeno. 7ª. La cepa C4 de Lactobacillus plantarum no induce producción de la citokina proinflamatoria TNF- por la línea de macrófagos murinos Raw 264.7, lo que indica que esta bacteria probiótica carece de actividad inflamatoria per se. 8ª. La cepa C4 de Lactobacillus plantarum potencia la respuesta de TNF- inducida por la bacteria enteropatógena Yersinia enterocolitica O9 en la línea de macrófagos murinos Raw 264.7, lo que demuestra que la cepa C4 es capaz de estimular la inmunidad innata en situaciones de infección por esta bacteria. 9ª. Las determinaciones de producción de IFN- por células Raw 264.7 sugieren que la infección por Yersinia enterocolitica O9 se asocia a una moderada disminución de la resistencia antiviral, que es restaurada por acción de la Lactobacillus plantarum C4. 10ª. La administración intragástrica de una dosis diaria de la cepa probiótica Lactobacillus plantarum C4 a ratones BALB/c, durante un periodo de 18 días, no ocasionó variaciones significativas en el número de esplenocitos, lo que corrobora la ausencia de capacidad patógena en esta cepa. 11ª. La administración de Lactobacillus plantarum C4 a ratones BALB/c, no indujo ninguna modificación significativa en la capacidad de los esplenocitos para proliferar en respuesta a los mitógenos lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas y concanavalina A, que actúan sobre los linfocitos B y T, respectivamente, lo que sugiere una ausencia de efectos sobre la inmunidad sistémica en animales inmunocompetentes. 12ª. El pretratamiento de ratones BALB/c con L. plantarum C4 disminuyó el tiempo de colonización de Y. enterocolitica O9 en las placas de Peyer de ratones. Este efecto estuvo asociado al estado proinflamatorio de la mucosa intestinal determinado por el aumento en la producción de TNF- y un aumento en la secreción total de IgA. 13ª. La administración de Lactobacillus plantarum C4 a ratones BALB/c, no indujo una respuesta proinflamatoria a nivel sistémico pero si un aumento en la producción de la citokina inmunoreguladora IFN-. 14ª. La administración de la cepa probiótica L. plantarum C4 a ratones BALB/c durante un periodo de 18 días, incrementó la resistencia a la infección intestinal con Y. enterocolitica O9 a través de su actividad inmunomoduladora. Bibliografia: OMS: Organización Mundial de la Salud. Global Health Estimates 2015 Summary Tables: Global deaths by cause, age and sex, 2000-2015. http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/en/ (consultada en agosto de 2017). Binns N. (2013). Probiotics, Prebiotics and Gut Microbiota. Monografías del Instituto Internacional de Ciencias de la Vida de Europa/ “Europa International Life Sciences Institute - ILSI”. http://ilsi.org/publication/probiotics-prebiotics-and-the-gut-microbiota/ (consultada en junio 2017).