Implicaciones biológicas de genes de vías de señalización de insulina, inflamación y matriz extracelular en cultivos de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano

Resumen

Introducción La obesidad es un problema importante de salud pública y se caracteriza por una acumulación excesiva de grasa en el tejido adiposo, que puede ocurrir por un aumento del volumen del adipocito (hipertrofia), número de éstos (hiperplasia), o bien, una combinación de ambos (hipertrofia-hiperplasia). Además, la obesidad se asocia con un estrés oxidativo y una inflamación de bajo grado en el tejido adiposo; y esto es un factor de riesgo para el síndrome de resistencia a la insulina (IR), diabetes tipo 2 y otras co-morbilidades (Morigny et al. 2016). El tejido adiposo es el principal órgano de almacenamiento de energía. Contiene adipocitos y, además, una gran población de células como son los macrófagos, fibroblastos, pericitos, células sanguíneas, células endoteliales, células del músculo liso, células madre mesenquimales y células precursoras. Todas éstas células se encuentran localizadas en la fracción del estroma vascular (SVF) y la composición celular y fenotípica de las SVF son, normalmente, diferentes dependiendo de la localización y de la adiposidad corporal (Wang et al. 2014). La adipogénesis es el proceso de diferenciación celular mediante el cual los preadipocitos llegan a ser adipocitos y se ha estudiado intensamente, utilizando diferentes modelos de diferenciación celular. Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (del inglés Adipose-derived stem cells, ADSCs) son una población multipotente encontrada en este tejido, capaces de ser adherentes, poseer un potencial trilineal de diferenciación y expresar diferentes marcadores de diferenciación. Además, las ADSCs pueden diferenciarse hasta diferentes líneas celulares, incluyendo los adipocitos (Volz et al. 2016). La principal ventaja de las ADSCs son su alta capacidad de expansión, su capacidad para soportar un número elevado de pases y la posibilidad de ser congeladas durante largos períodos de tiempo (Lee et al. 2014). En los últimos años, se han estudiado muy a fondo el proceso de diferenciación de líneas celulares de fibroblastos hasta adipocitos (Wang et al. 2014) y se dispone de diferentes modelos de cultivo celular y protocolos con el objeto de estudiar la biología del adipocito. Por otro lado, existen tres tipos de tejido adiposo en los mamíferos, el tejido adiposo blanco (del inglés white adipose tissue, WAT), el tejido adiposo marrón (del inglés Brown adipose tissue, BAT) y el tejido adiposo beige o BRITE (del inglés beige adipose tissue, bAT). Éstos tipos de tejido se diferencian según la composición celular, localización, vías de señalización y control homeostático, capacidades metabólica y endocrina, funciones y respuestas (Lanthier et al. 2014). El WAT es el principal lugar de reserva energética, pero es también un órgano endocrino que secreta citoquinas y adipocitoquinas (Baraban et al. 2016). El tejido adiposo subcutáneo (del inglés subcutaneous adipose tissue, SCAT) y depósitos viscerales representan el 80% y 20%, respectivamente, del almacenamiento de grasa del organismo. El BAT está especializado en el consumo de grasa para la generación de calor y aumentar el gasto energético, relacionado con la termogénesis y defensa contra el frío y, eventualmente, la obesidad (Baraban et al. 2016). Al igual que los adipocitos marrones, los adipocitos beige tienen numerosas mitocondrias y expresan altos niveles de la proteína desacoplante UCP1 y solamente expresan genes termogénicos (UCP1 y otros) en respuesta a una activación específica (Harms et al. 2013). En cuanto a las comorbilidades derivadas de la obesidad, en las últimas dos décadas, se han publicado diferentes moléculas y hormonas como mediadores implicados en procesos metabólicos asociados a dicha obesidad. En este sentido, los péptidos natriuréticos son una familia de hormonas peptídicas que han sido descritos como mediadores de esos procesos metabólicos, a través de la interacción con sus receptores (del inglés natriuretic peptide receptors NPRs): NPR1/NPR-A, NPR2/NPR-B y NPR3/NPR-C (Gruden et al. 2014). El receptor 3 de los péptidos natriuréticos (NPR3) se ha considerado, clásicamente, como un receptor de aclaramiento que se encuentra involucrado en la degradación de dichos péptidos (Schlueter et al. 2014). Sin embargo, diferentes estudios han demostrado que el NPR3 podría estar implicado en algunos procesos metabólicos. En este sentido, se ha descrito que la obesidad se asocia con un descenso de los niveles circulantes del péptido natriurético atrial (ANP) y del péptido natriurético cerebral (BNP), y además, se ha observado una sobreexpresión del gen NPR3 en el WAT de personas con obesidad, tanto en adultos (Gómez-Ambrosi et al. 2004) como en niños (Aguilera et al. 2015). En este aspecto, diferentes estudios han demostrado que el NPR3 se encuentra acoplado al sistema adenilato ciclasa en varios tejidos humanos. Así, se ha asociado con los niveles de AMP cíclico (AMPc) en diferentes tejidos, utilizando un péptido sintético, el C-ANP4–23, análogo al ANP que interacciona específicamente con el NPR3 (Anand-Srivastava et al. 1990). En relación al estrés oxidativo, la obesidad conduce a una producción excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el tejido adiposo, incluyendo el peróxido de hidrógeno (H2O2), el anión superóxido (O2-) y el radical hidroxilo (OH-). En particular, el H2O2 es una de las formas más abundantes de los ROS en los adipocitos y los niveles están regulados por diferentes enzimas como son la catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPX), superóxido dismutasa (SOD) y las peroxirredoxinas (PRDXs) (Gough et al. 2011, Rupérez et al. 2014). Aunque el H2O2 es una molécula de señalización importante a niveles controlados, un aumento en su producción puede determinar alteraciones metabólicas en los adipocitos. Además, se conoce que el estrés oxidativo puede activar la vía de inflamación del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-κB) (Sasaki et al. 2005). Igualmente, los ROS pueden también disminuir la expresión del receptor activado por proliferador de los peroxisomas-gamma (PPAR-γ) (Chen et al. 2006), que, a su vez, puede regular la expresión de CAT en el tejido adiposo (Okuno et al. 2008). La CAT es una de las enzimas antioxidantes más importantes en las células. Se encuentra localizada en los peroxisomas y degrada el H2O2 que excede los niveles fisiológicos. Se ha observado que la expresión de CAT aumenta tras una restricción calórica en el tejido adiposo de ratones obesos (Lijnen et al. 2012). Sin embargo, su expresión se encuentra aumentada en el corazón de ratones que han sido alimentados durante 30 semanas con una dieta alta en grasa, posiblemente como mecanismo de compensación del descenso significativo observado en la actividad específica de CAT (Rindler et al. 2013). En humanos, se ha demostrado que la actividad de la CAT en los eritrocitos se encuentra disminuida en adultos obesos (Amirkhizi et al. 2014) y, además, en niños con resistencia a la insulina y obesidad (Rupérez et al. 2013). Antecedentes y objetivos del estudio El grupo de investigación “CTS-461 Bioquímica de la nutrición. Implicaciones terapéuticas, BioNIT” centra una de sus principales líneas de investigación en el estudio de la obesidad. En principio, el grupo llevó a cabo algunos estudios de asociación de variantes genéticas (del inglés sigle nucleotide polymorphism, SNPs) con el riesgo de desarrollar obesidad infantil como son los genes 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 (HSD11B1), neuropéptido Y (NPY) y el gen asociado a la obesidad y masa grasa (del inglés fat mass and obesity associated, FTO) (Tesis doctoral defendida por Olza J. 2011) (Olza et al. 2012). Posteriormente, el grupo de investigación estudió las implicaciones potenciales de algunos SNPs de genes relacionados con el sistema de defensa antioxidante, el riesgo de obesidad y algunas características del síndrome metabólico en niños; tesis defendida por Rupérez AI (2014) (Rupérez et al. 2013, Rupérez et al. 2014). Además, el grupo de investigación demostró que el tejido adiposo visceral muestra una expresión génica diferencial entre niños obesos y niños normopeso prepúberes (Aguilera et al. 2015). Consecutivamente, el grupo obtuvo un proyecto de la Junta de Andalucía (proyecto número CTS-6770), que permitió estudiar algunos genes seleccionados que pueden afectar a la obesidad y sus complicaciones metabólicas como son la inflamación y la resistencia a la insulina. De esta forma, se seleccionaron los genes NPR3 y CAT, entre otros, para estudiar su posible función en el metabolismo del adipocito y su asociación con la obesidad. El presente trabajo fue diseñado para determinar la posible función de los genes NPR3 y CAT en el metabolismo del adipocito, además para estudiar el mecanismo específico por el cual podrían contribuir a las alteraciones metabólicas asociadas a la obesidad en adipocitos humanos diferenciados. Material y métodos En el presente estudio, se adquirió una línea celular comercial de células madre mesnquimales derivadas de tejido adiposo humano (ADSCs) de la firma Lonza. Las ADSCs se cultivaron, expandieron y diferenciaron hasta adipocitos siguiendo las recomendaciones del fabricante (Lonza). A continuación, las ADSCs se diferenciaron hasta adipocitos maduros durante 12 días y las muestras se recolectaron en diferentes tiempos (día 0, 5, 9 y 12) y la adipogénesis se comprobó y cuantificó mediante el ensayo de tinción con un colorante lipídico “Oil Red O”, examinando morfológicamente la acumulación de gotas de lípidos en las células a diferentes tiempos (d0, d5, d9 y d12). Finalmente, todos los tratamientos a posteriori se realizaron en los adipocitos a día 10.