Regulación e impacto epigenético del elemento móvil humano line-1 en un genoma pluripotente

Abstract

LINE-1 o L1 (Long INterspersed Element class 1) es un tipo de ADN móvil, concretamente un retrotransposón autónomo de la clase no LTR (Long Terminal Repeats), que se encuentra actualmente activo en el genoma humano. Existen unas 500.000 copias en el genoma, ocupando un 17% del mismo, y de las cuales se estima que tan solo 80-100 copias son retrocompetentes o activas. Éstas tienen una longitud de 6 kb, presentan una región no traducida con actividad promotora y dos marcos abiertos de lectura que codifican la maquinaria enzimática requerida para su movilización. Los elementos LINE-1 retrocompetentes se movilizan mediante un mecanismo de “copia y pega” denominado retrotransposición, generando una nueva copia del elemento en otra localización genómica, usando un intermediario de ARN. La retrotransposición, que mayoritariamente se produce en etapas tempranas de desarrollo, inserta una nueva secuencia de DNA en el genoma y esto produce una serie de consecuencias para el genoma, pudiendo incluso causar una nueva enfermedad. De hecho, se han identificado más de 100 enfermedades asociadas a la actividad de LINE-1. Por ello, existen diversos mecanismos celulares para el control de la retrotransposición. Uno de estos mecanismos es la inhibición de la expresión de L1 activos, por medio de modificaciones de histonas. De hecho, existen evidencias de que las copias de LINE-1 presentes en el genoma humano podrían estar reguladas por modificaciones de histonas y por metilación de ADN. Además, se ha demostrado que la mayoría de las nuevas inserciones de L1 en células humanas pluripotentes, producidas desde plásmidos que contienen elementos L1 retrocompetentes recombinantes, son silenciadas epigenéticamente mediante desacetilación de histonas. Sin embargo, se desconocen cuáles son las modificaciones de histonas implicadas en esta represión de las nuevas inserciones de LINE-1 cuando se integran en el genoma humano, así como el impacto epigenético de las nuevas inserciones sobre el genoma adyacente durante el desarrollo embrionario temprano. Para conocer más de esta regulación y su impacto epimutagenico, en esta tesis se ha utilizado un nuevo vector de retrotransposición y se han generado una batería de líneas clonales conteniendo una nueva inserción de LINE-1, usando células pluripotentes humanas (células de carcinoma embrionario y células madre embrionarias). Posteriormente, se ha determinado el sitio de la nueva inserción de L1 y mediante inmunoprecipitación de cromatina cuantitativa se ha determinado que la mayoría de las nuevas inserciones de LINE-1 están silenciadas epigenéticamente, mediante trimetilación de la lisina 9 de la histona 3 (H3K9me3). Además, se ha demostrado que algunas de las nuevas inserciones de LINE-1 generan cambios en los niveles de enriquecimiento de H3K9me3 en el genoma adyacente llegando estos cambios hasta 1-1,5kb desde el sitio de inserción. Por otro lado, también se han generado datos que sugieren que las inserciones nuevas endógenas de LINE-1 en células madre embrionarias humanas podrían también ser silenciadas a través de H3K9me3. Sorprendentemente, una de las inserciones endógenas se encontraba epigenéticamente activa al estar su promotor enriquecido en trimetilación de la lisina 4 de la histona H3 (H3K4me3), estando así preparada para un nuevo ciclo de retrotransposición. Ambos hallazgos son importantes, pues constituyen, por un lado el primer dato existente de que una nueva inserción de un retrotransposón puede generar “epimutaciones” pudiendo tener un gran impacto funcional dependiendo de su localización y, por otro lado, la primera evidencia de que una nueva inserción endógena de LINE-1 puede permanecer epigenéticamente activa después de su integración en el genoma humano.