Caracterización del efecto citotóxico inducido por nuevos derivados del benzo[b]tiofeno-6-sulfonamida 1,1-dióxido en células tumorales

Resumen

Los derivados del benzo[b]tiofenosulfonamida 1,1-dióxido (BTS) son un grupo de compuestos con actividad antitumoral. Con el fin de obtener nuevas sustancias con la máxima actividad citotóxica sobre células tumorales, recientemente se han sintetizado una nueva serie de compuestos derivados de benzo[b]tiiofenosulfonamida 1,1-dióxido. Algunos de estos compuestos a concentraciones 10 veces inferiores a las del BTS precursor presentan una actividad citotóxica en diversas líneas tumorales mayor, lo que los hace especialmente prometedores como agentes quimioterápicos. El objetivo fundamental de este trabajo ha sido estudiar el mecanismo de acción de los nuevos derivados BTS en células tumorales, en la línea de leucemia T linfoblástica humana CCRF-CEMM. Los objetivos concretos han sido: 1. Estudiar si los BTS producen la muerte celular por apoptosis. 2. Analizar el efecto de los BTS sobre el ciclo celular. 3. Analizar la acción de los BTS sobre algunas proteínas que regulan la apoptosis y el ciclo celular: a. Proteínas implicadas en la regulación de la apoptosis: caspasa 3, Bak, Bim, Bcl2 y BclxL b. Proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular: Cdk1, ciclinas A y B1 c. Proteína implicada en la regulación de ambos procesos. P53. 4. Estudiar la implicación de los radicales libres del oxígeno (ROS) en el mecanismo de acción de estos nuevos BTS. a. Cuantificar el efecto de los BTS sobre los niveles intracelulares de ROS. b. Analizar si el antioxidante N-acetil-cisteína modifica el efecto de los BTS. 5. Estudiar la implicación de la NADH-oxidasa asociada a tumores (tNOX) en el efecto citotóxico inducido por los compuestos BTS. Para ello se ha analizado de qué manera afecta la disminución de la concentración intracelular de esta proteína al efecto citotóxico de los BTS. Para la cuantificación de la apoptosis se ha utilizado la técnica de marcaje conjunto de las células con anexina-V-FITC e ioduro de propidio. El estudio del ciclo celular se ha realizado por cuantificación del DNA celular mediante tinción con ioduro de propidio. Los niveles intracelulares de ROS se han cuantificado utilizando el diacetato de 5 (y 6) carboxi-2¿,7¿diclorodihidrofluoresceína (CM-H2DCFDA). En los tres casos el estudio se ha realizado por citometría de flujo. Para determinar la activación de la caspasa 3 se ha utilizado un ensayo fluorimétrico. El análisis de la expresión de proteínas se ha realizado mediante inmunofluorescencia indirecta. En el estudio de la tNOX se han reducido los niveles de esta proteína silenciando la expresión del gen tNOX utilizando un RNA de interferencia. Se ha comprobado la efectividad del silenciamiento cuantificando los niveles de mRNA correspondientes a tNOX por RT-PCR a tiempo real y los niveles de proteína tNOX por Western-blot. El estudio de citotoxicidad se ha realizado mediante la técnica del MTT. Los resultados obtenidos demuestran que los nuevos BTS producen la muerte celular por apoptosis siendo más efectivos aquellos compuestos más lipófilos. Estos compuestos inducen apoptosis activando la vía intrínseca ya que se ha encontrado un aumento en la actividad de la caspasa 3 y en los niveles de expresión de las proteínas apoptóticas Bak y Bim, así como una disminución en las proteínas antiapoptóticas Bcl-2 y Bcl-xL. Por otra parte, estos compuestos provocan un bloqueo del ciclo celular en la fase G2/M, disminuyendo la expresión de las proteínas reguladoras de esta fase, las ciclinas A y b1 y la quinasa Cdk1. Se ha encontrado un aumento en la expresión de la proteína p53. Este resultado parece indicar que el bloqueo del ciclo celular y la apoptosis inducida por los BTS, podría estar mediada por p53. Además, nuestros resultados muestran que existe una correlación lineal entre el efecto apoptótico y los niveles intracelulares de ROS inducidos por estos compuestos. El antioxidante NAC (N-acetil-cisteína) revierte, en parte, la apoptosis, el bloqueo en fase G2/M y las alteraciones de las proteínas reguladoras inducidas por los BTS. Esto indica que los ROS son importantes mediadores en los efectos inducidos por los BTS. Finalmente, se ha encontrado que disminuyendo los niveles de la NADH oxidasa asociada a tumores se inhibe el efecto citotóxico inducido por los BTS. Esto sugiere que esta enzima, específica de células tumorales, podría ser una posible diana molecular de los compuestos BTS, lo que los hace especialmente prometedores como agentes quimioterápicos.