Estudio de la utilidad del análisis de perfiles de micrornas plasmáticos en la clasificación pronóstica en pacientes con síndrome mielodisplásico (smd) y cariotipo normal

Resumen

Introducción Los síndromes mielodisplásicos (SMD) son un grupo heterogéneo de neoplasias hematológicas mieloides, caracterizadas por fallo medular progresivo y riesgo aumentado de transformación a leucemia mieloide aguda. Es una alteración clonal de la célula madre hematopoyética, identificada por las anomalías en la morfología de los elementos celulares o displasia. La incidencia real de los SMD es desconocida. Las estimaciones en Europa oscilan entre 3 y 20 casos por cada 100.000 habitantes/año, en población con una mediana de edad al diagnóstico de 76 años y clara asociación con el envejecimiento poblacional. La clasificación de los SMD ha ido modificándose con la evolución en las técnicas de estudio citogenético. La clasificación actual es la versión revisada por la OMS en 2008 que incluye las categorías de citopenia refractaria con displasia unilínea (anemia, AR, neutropenia, NR, trombopenia, TR), anemia refractaria con sideroblastos en anillo (ARSA), citopenia refractaria con displasia multilínea (CRDM), CRDM con sideroblastos en anillo (CRDM+SA), anemia refractaria con exceso de blastos-1/2, SMD inclasificable (SMDi) y síndrome 5q-, este último una entidad provisional. Esta clasificación, se asocia con el reconocimiento de diferentes alteraciones cromosómicas recurrentes que aún en ausencia de signos inequívocos de displasia pueden ser diagnosticados como SMD. Los SMD pueden ser entidades de novo o secundarias a la terapia, enfermedades autoinmunes o de otra índole. El International Prognosis Scoring System (IPSS) y la versión revisada de este, el IPSS-R son escalas de valoración pronóstica. El IPSS fue definido en 1997 por Greenberg et al, es la escala utilizada en los ensayos clínicos y en la ficha técnica de los fármacos disponibles. Define 4 grupos pronósticos que se pueden fusionar en bajo riesgo (riesgo bajo + intermedio-1), y alto riesgo (intermedio-2 + alto), esta escala puntúa el numero de citopenias, el porcentaje de blastos y algunas alteraciones cromosómicas. El IPSS-R, fue desarrollado en 2011 por Greenberg et al, incluyendo en la clasificación el riesgo citogenético de 5 categorías de Schanz et al, de 2011 (muy bajo, bajo, intermedio o indeterminado, alto y muy alto riesgo), asignando puntuación al 90% de las alteraciones cariotipicas. Hasta la actualidad el IPSS-R, constituye la mejor herramienta pronóstica considerando la presencia de alteraciones citogenéticas, sin embargo, alrededor del 50% de los pacientes con SMD no presentan alteraciones en el cariotipo, por lo que son categorizados en riesgo muy bueno, bueno e intermedio, dificultando una adecuada clasificación pronostica y por ende su manejo. Los pacientes con SMD/Leucemia mieloide aguda con cariotipo normal, son objeto de estudio para identificar otros marcadores pronósticos. Los microRNAs o miRNAs, son pequeñas moléculas unicatenarias de RNA conformadas por 18-25 nucleótidos, cuyas funciones se han relacionado con la regulación de la maquinaria de traducción del RNA mensajero en los ribosomas o en el núcleo actuando como promotores o represores de la transcripción de diferentes genes, con implicación en la hematopoyesis y en los procesos neoproliferativos. Hipótesis Así como las alteraciones citogenéticas, ayudan a predecir el comportamiento de los SMD, la identificación de un perfil de miRNAs en los pacientes con cariotipo normal (y que por ende carecen de esa información) puede ayudar a mejorar su clasificación pronóstica. Objetivos El presente trabajo, se ha desarrollado en diferentes fases con el objetivo de cumplir 5 objetivos: 1.- Identificar la presencia de perfiles de miRNAs en muestras de pacientes con SMD respecto a controles, 2.- Comparar la variabilidad del perfil de miRNAs en dependencia de si se ha utilizado muestra de células de sangre periférica o de plasma acelular, 3.- explorar la utilidad del perfil de miRNAs como herramientas que soporten el diagnóstico de SMD, 4.- Definir si los pacientes con SMD y cariotipo normal presenten un perfil de expresión diferente y 5.- explorar el valor pronóstico de dicho perfil en los pacientes con SMD y cariotipo normal. Métodos Para alcanzar dichos objetivos se realizaron diferentes fases, desde la puesta a punto de la técnica para cuantificar miRNAs en muestras de sangre periférica, la creación del perfil de miRNAs mediante un cribado y el análisis posterior de los resultados. En la primera fase se realizó un análisis de cribado de 742 miRNAs en 40 muestras de pacientes de nuevo diagnóstico de SMD y 40 controles, para ello se utilizó la plataforma Human Plasma A y BTM; se analizaron sus niveles, tanto en células de sangre periférica como en plasma acelular. En esta fase se identificó un perfil de 14 miRNAs, que mostraban una expresión diferencial respecto a los sujetos control ajustados por edad y sexo. Asimismo, al comparar los resultados de dicho perfil en dependencia de las muestras analizadas, se observo que salvo Let-7e, todos los demás miRNAs mostraban una mayor expresión en plasma acelular, por lo que se seleccionó el plasma acelular como la fuente de miRNAs para los sucesivos estudios. Al analizar la expresividad de los diferentes miRNAs en plasma acelular, se conformo el perfil final de 19 miRNAs que incluyo a los siguientes: 1.- Has-miR-625-5p 2.- Has-let-7a-5p 3.- Has-let-7e-5p 4.- Has-miRNA-140-3p 5.- Has-miRNA-15a-5p 6.- Has-miRNA-15b-5p 7.- Has-miRNA-17-5p 8.- Has-miRNA-19b-3p 9.- Has-miRNA-24-3p 10.- Has-miRNA-25-3p 11.- Has-miRNA-26a-5p 12.- Has-miRNA-30b-5p 13.- Has-miRNA-361-3p 14.- Has-miRNA-378a-3p 15.- Has-miRNA-378a-5p 16.- Has-miRNA-451ª 17.- Has-miRNA-625-3p 18.- Has-miRNA-942 19.- Has-miRNA-99b-5p Finalizada la puesta a punto de la técnica de PCR necesaria para el estudio del perfil, el estudio se amplio al incluir una cohorte de 242 muestras procedentes del grupo INBIOMED para validar los resultados primarios. Se analizó el perfil completo en las muestras de plasma acelular, de toda la cohorte. Se utilizaron los sistemas de clasificación FAB, OMS 2008, IPSS, WPSS, IPSS-R y escala de riesgo citogenético de 5 categorías, los casos con ausencia de alteraciones en el cariotipo convencional mediante bandeo G e inmunofluoresencia con hibridación in situ, se consideraron como SMD con cariotipo normal. Resultados y Discusión El grupo estaba constituido por 141 hombres y 87 mujeres (14 casos sin dato de género asociado). Acorde a la clasificación OMS 2008, LMMC: 5, AREB-1: 31, AREB-2: 19, ARSA: 13, CRDU: 22, CRDM: 109, SMD hipoplásico: 2, SMD inclasificable: 6, Síndrome 5q-: 15, LMA: 6. Categoría de riesgo citogenético: sin datos: 11, muy bueno: 11, bueno: 169 (cariotipo normal 154), intermedio 29, malo: 14, muy malo: 10. La clasificación pronostica por IPSS-R fue : muy bajo: 59, bajo: 93, intermedio: 37, alto: 27 y muy alto riesgo: 12. La mediana de seguimiento de la cohorte fue de 29,55 (2-76) meses, se registraton 99 (40,9%) fallecimientos, la mayoría de ellos relacionados con SMD. La mediana de supervivencia global (SG) fue de 51 (43,1-55,8) meses, la media de tiempo de SG fue de 44,8 (40,7-49,1) meses. Siguiendo la distribución acorde a los grupos IPSS-R las medianas de supervivencia global fueron: bajo riesgo: 60 (49,2-70,7) meses, riesgo intermedio 27 (19,6-34,3) meses, riesgo alto 14 (10,3-17,6) meses y para muy alto riesgo 11 (3,0-18,9) meses, para el grupo de bajo riesgo durante los dos años de seguimiento no se había alcanzado la mediana, la media estimada por Kaplan-Meyer fue de 54,3 (46,5-62,0) meses. En el análisis de SLP para los grupos de muy bajo y bajo riesgo las medianas no fueron alcanzadas, las medias fueron 67,5 (64,0-79,9) y 56,0 (52,4-59,6) meses respectivamente, para el grupo intermedio, la mediana de SLP fue de 64 (1,7-126,2) meses, para el grupo de alto riesgo fue de 19,0 (0,1-43,2) meses y de 8,0 (5,1-10,8) meses para el de muy alto riesgo. Este trabajo ha permitido mediante un sistema de cribado que incluyó 754 miRNAs, identificar un perfil de 19 miRNAs diferencialmente expresados tanto en células como en plasma acelular de sangre periférica. El análisis se realizó utilizando una expresión logarítmica de Log10 y utilizando la formula 2-dd(Ct) para ajustar los resultados de expresión acorde a los valores del gen normalizador, en este caso miR-16 y a los valores de expresión de los sujetos controles. Una vez con los resultados de expresión de la cohorte, se procedió al análisis con el fin de dar respuesta a los objetivos planteados. En este perfil destacaron miR-26a, miR-99b, miR-15b y mir-361-3p por ser los mayormente expresados. Este perfil es único y no comparable con los trabajo publicados hasta ahora debido a la novedad del uso del plasma acelular y del método de cribado diferente, un aspecto ampliamente abordado en el capitulo de discusión. Al comparar la expresión entre células y plasma acelular, se evidencio que la expresión es similar, con tendencia a valores de expresión superiores en las muestras de plasma acelular, salvo para miR-Let-7e, donde el valor mas alto fue observado en muestra celular. El hecho de identificar que el plasma acelular de sangre periférica es una muestra fiable y de fácil manejo y obtención hizo propicio su elección para los subsiguientes estudios. Dentro de nuestro perfil de miRNAs, miR-26, miR-625 y miR-24 ofrecen una expresión diferencial estadísticamente significativa con respecto a los controles, independientemente de la clasificación diagnostica o pronóstica de SMD, lo cual aboga por la utilidad de los miRNAs como biomarcadores que ayuden a establecer el diagnostico en casos frontera, evitando las subjetividades inter observador. Al analizar los patrones de expresión del perfil testado entre los pacientes con cariotipo normal frente a los de cariotipo alterado se observó que los miRNAs miR-99b, Let-7a-5p, miR-15a-5p, miR-24-3p, miR-378a-3p y miR-378a-5p, mostraron una expresión diferencial estadísticamente significativa entre ambos grupos, debe destacarse que respecto a los controles, su expresión estaba incrementada, pero relativamente menos expresada en los pacientes con cariotipo normal, por lo que su utilidad a la hora de diferenciar entre casos de SMD con alteraciones de cariotipo, frente a cariotipo normal es evidente. Al analizar los datos relativos únicamente a la cohorte de 154 casos con SMD con cariotipo normal, hasta ahora la cohorte mas grande de estas características en estudios de miRNAs. Al analizar las diferencias de expresión del perfil de miRNAs, se observo que los microRNAs: miR-625-3p/5p, miR-24-3p, miR-26a-5p, miR-30b-5p, miR-378-3p y miR-99b-5p mostraron las mayores variaciones de expresión dentro de la cohorte. Al correlacionar esta expresión con la presencia de fallecimiento o progresión a LMA y subdividir la cohorte según se haya registrado exitus o no; la expresión de miR-99b-5p, Let-7e-5p y miR-24-3p fue significativamente diferente con p<0,001, p<0,001 y p=0,005 respectivamente, la mayor expresión de los miRNAs se asoció con la presencia de exitus en la cohorte. Al aplicar ese mismo análisis tomando como evento la progresión a leucemia mieloide aguda se obtuvo que los miRNAs: Let-7e-5p, miR-99b-5p y miR-24-3p volvieron a presentar una expresión diferencial significativa, con valores de p<0,000 para los dos primeros y de p=0,009 para miR-24-3p, correlacionando su mayor expresión con el riesgo de progresión a LMA. Destacando la influencia negativa en el pronostico de la expresion de estos tres miRNAs, independientemente del grupo pronostico. Al analizar la distribución de Let-7e, miR-99b y miR-24-3p, se obtuvo que Let-7e y miR-99b presentaban una distribución homogénea y por ello se seleccionaron para conformar, en combinación con el esquema IPSS-R, un esquema pronostico con las siguientes categorías: 1.- Muy bajo riesgo sin sobreexpresión. 2.- Muy bajo riesgo con sobreexpresión. 3.- Bajo riesgo sin sobreexpresión. 4.- Bajo riesgo con sobreexpresión. 5.- Riesgo intermedio sin sobreexpresión 6.- Riesgo intermedio con sobreexpresión. Al realizar esta aproximación pronóstica se observó un valor predictivo mediante curva ROC de 0,786 para progresión a leucemia mieloide aguda y de 0,752 para supervivencia global, mejorando la fuerza pronostica de los diferentes modelos por separado. En la siguiente tabla se presenta de forma resumida la separación entre los grupos de riesgo IPSS-R (N=150) entre dos subgrupos en dependencia de la ausencia o presencia de sobrepexpresión de Lat-7e + miR-99b. El grupo de alto riesgo no se incluye al tener una muestra limitada (10 casos). La descripción completa esta en el texto. Tabla 0.1. resumen subdivisiones entre IPSS-R y modelo combinado. Grupo IPSS-R SG IPSS-R SG Mod. combinado SLP IPSS-R SLP Modelo Combinado Muy Bajo (N=52, 34,7%) 54,0 (42,7-60,5) 54,0 (33,9-74,1) 53,9 (51,2-56,7)* 100% SLP 46,0 (17,7-80,7) 88% SLP Bajo (N=71, 47,3%) 55,0 (35,2-74,9) 55,0 (46,1-63,9) 56,5 (52,6-60,4)* 59,5 (56,1-62,9) 32,0 (20,5-43,4) 43,7 (35,5-51,8) Intermedio (N=17, 11,3%) 26,0 (15,2-36,7) 26,0 (14,9-37,1) 64,0 (9,4-118,5) 56,8 (35,5-78,1) 24,0 (6,5-41,5) 24 (0,1-49,1) * medias, las medianas no habían sido alcanzadas. Este sistema permitió un ajuste pronóstico, identificando pacientes de alto riesgo inicialmente catalogados en el grupo de riesgo muy bajo o bajo que alcanzaban medianas de supervivencia inferiores a 3 años y por ende susceptibles de tratamiento. En el subgrupo de riesgo intermedio, permitió reclasificar a pacientes con alto riesgo de progresión a LMA (65% de progresión a 2 años), también candidatos a terapia modificadora de la historia natural de la enfermedad, una posible mejora en el camino hacia una medicina personalizada adaptada al riesgo. Los miRNAs, Let-7e y miR-99b, son parte del clúster de Let-7e, miR-17 y miR-99b, ubicados en el cromosoma 19, este clúster ha sido descrito implicado en diferentes procesos celulares y con una expresión descrita de forma independiente de los 3 miRNAs, sin embargo esta es la primera vez que se pone en evidencia la participación de estos miRNAs en casos con SMD. Este análisis, es hasta ahora, la primera herramienta que precisa el pronóstico del subgrupo de pacientes con SMD de cariotipo normal, al utilizar los datos obtenidos en el modelo IPSS-R y potenciarlos con el uso de los análisis de expresión de los microRNAs. Se han cumplido los objetivos planteados y se puede afirmar que los miRNAs son biomarcadores epigenéticos útiles tanto para el diagnostico de casos de SMD, en los casos con cariotipo normal como mejorando el ajuste pronóstico hasta ahora alcanzado por el IPSS-R mediante la combinación del análisis de las características citogenéticas, citológicas y epigenéticas en sangre periférica.