Regulación de nkcc2 por la proteína kinasa dependiente de amp en modelos in vitro de asa de henle

Resumen

NKCC2 es un cotransportador Na+/K+/Cl- que se expresa en la membrana apical de las células del tramo grueso ascendente de Asa de Henle, TAL. Es el responsable de la absorción luminal de sodio en TAL y su función es crítica para el mantenimiento de la presión arterial. Su regulación es muy compleja y hay muchas moléculas implicadas en ella. Se han descrito interacciones entre NKCC2 y AMPK aunque no se conoce muy bien su papel en la regulación de NKCC2. Los modelos para el estudio de NKCC2 existentes hasta el momentos son deficientes y se plantea el desarrollo de un modelo adecuado para el estudio de NKCC2 en condiciones fisiológicas que permita estudiar su regulación por AMPK y explicar los mecanismos que intervienen en ella. Primero se validaron las células raTAL, donadas por el grupo del Dr.Ferreri, como modelo de Asa de Henle. Se observó que, aunque mantenían una morfología epitelial, no expresaban NKCC2 por lo que no se dio por válido para el estudio este modelo. Posteriormente se intentó una transfección heteróloga de NKCC2 humano en las células raTAL utilizando el vector comercial M55 que incluía una proteína de fusión entre mCherry y NKCC2 humano. En las transfecciones transitorias se observó expresión del cotransportador inmaduro mientras que en las transfecciones estables se observó expresión de mCherry desnudo en lugar de formando una proteína de fusión con NKCC2. Por estos motivos se desechó la expresión heteróloga de NKCC2 en raTAL como modelo para el estudio de la regulación de NKCC2 por AMPK. Finalmente se decidió establecer cultivos primarios a partir de la médula renal de dos ratones. Se establecieron las condiciones de obtención del material y de cultivo adecuadas y, posteriormente, se utilizaron ratones knock-out condicionales renales para las subunidades catalíticas de AMPK, α1 y α2, para establecer los cultivo primarios de TAL. Al analizar la expresión de AMPKα1 y AMPKα2 en los cultivos se determinó que en el material de partida de los cultivos había un descenso significativo de la cantidad de proteína de AMPKα1 y AMPKα2 por lo que sería un material válido para el estudio de la regulación de NKCC2 por AMPK. Sin embargo, al analizar las muestras obtenidas en un cultivo en pase 1 se observó que, aunque había un descenso significativo en la expresión de AMPKα2 en células KCD respecto a células CD, se producía un incremento, también significativo, en la expresión de AMPKα1 en células KCD respecto a células CD. Esto podía ser debido a mecanismos compensatorios ya descritos anteriormente en los que, en ausencia de una de las dos subunidades catalíticas de AMPK, la subunidad restante se sobreexpresaba para compensar esta perdida. Al realizar el mismo estudio en células en pase 2 se observó una pérdida total de la expresión de NKCC2 tanto en células KCD como en células CD mientras que las diferencias existentes en la expresión de AMPKα1 desaparecían y las diferencias en la expresión de AMPKα2, aunque continuaban siendo significativas, mostraban tendencia a igualarse entre los dos genotipos KCD y CD. Esto podía ser debido a la desdiferenciación de los cultivos que se había observado anteriormente y a la selección aleatoria de células de estirpe no renal en el cultivo. Las conclusiones del trabajo fueron las siguientes: • Hemos diseñado una herramienta que nos permite detectar el nivel de expresión de NKCC2 in vivo a tiempo real sin necesidad de sacrificar las células. • Las células raTAL no sirven como modelo de estudio de la función y regulación de NKCC2 en el TAL porque, aunque mantienen la morfología epitelial característica de estas células y la expresión de marcadores típicos de células epiteliales como ZO1 y de marcadores de TAL como THP, no expresan NKCC2. • Las células raTAL no son un buen modelo de expresión heteróloga de NKCC2. Las células expresan NKCC2 inmaduro tras una transfección transitoria y, tras la selección por antibiótico, hay mayor probabilidad de seleccionar células que hayan incorporado constructos incompletos. • Con el método de aislamiento por exclusión de tamaño en el que realizamos una digestión con colagenasa al 0,04% y un posterior filtrado a través de un tamiz de 40μM obtenemos un material de partida del cultivo de una buena pureza. • La fracción M40 (el material que queda retenido en el filtro de 40μM), cultivado en matrigel, es la mejor condición para establecer nuestro cultivo primario de TAL. En ella prevalece la morfología epitelial frente al resto de morfologías descritas y en un 20% de las colonias estudiadas se mantiene la expresión de NKCC2. • Los animales que expresan la recombinasa Cre muestran niveles reducidos de las dos subunidades catalíticas de AMPK en túbulos aislados de TAL, por lo que pueden ser un modelo válido para estudiar sus efectos en la regulación de NKCC in vitro. • La reducción en las subunidades catalíticas de AMPK se acompaña del aumento aparente en la expresión génica de NKCC2 en los cultivos primarios de TAL. A nivel de proteína se observa la reducción del tamaño molecular de NKCC2 en estos animales. • A lo largo de los pases la recombinación de AMPKα1 y AMPKα2 y la expresión de NKCC2 desaparece. Esto es debido a la desdiferenciación de los cultivos, a la prevalencia de estirpes no renales en el cultivo y a la reactivación de sistema Cre-LoxP en cada división mitótica. La bibliografía consultada para la elaboración de esta memoria ha sido la siguiente: - Arroyo JP, Kahle KT, Gamba G. The SLC12 family of electroneutral cation-coupled chloride cotransporters. Mol Aspects Med. 2013;34(2-3):288–98. - Giménez I. Molecular mechanisms and regulation of furosemide-sensitive Na-K-Cl cotransporters. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2006;15(5):517–23. - Fraser S a, Gimenez I, Cook N, Jennings I, Katerelos M, Katsis F, et al. Regulation of the renal-specific Na+-K+-2Cl- co-transporter NKCC2 by AMP-activated protein kinase (AMPK). Biochem J. 2007;405(1):85–93. - Kemp B, Stapleton D. AMPK 2002–2nd International Meeting on AMP-activated Protein Kinase. Biochem Soc. 2003;162–8. - Lang F, Föller M. Regulation of ion channels and transporters by AMP-activated kinase (AMPK). Channels. 2014;8(1):20–8 - Leyssac PP H-RN. Effects of various transport inhibitors on oscillating TGF pressure responses in the rat. 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