Deficiency of AE2 in mice predisposes to liver injury associated with reduced levels of glutathione, increased apoptosis and development of ama

Resumen

La cirrosis biliar primaria (PBC) es una enfermedad colestásica crónica que afecta sobretodo a mujeres de mediana edad. Inicialmente se observan infiltrados de células mononucleares en los espacios porta, junto a daño de los conductos biliares y subsiguiente ductopenia a lo largo del tiempo. Además, la PBC se asocia a fenómenos de autoinmunidad, con linfocitos T autoreactivos en los infiltrados portales y la aparición de anticuerpos antimitocondriales (AMA) frente a la subunidad PDC-E2 del complejo que convierte el piruvato en acetil-Coenzyma A. Las modificaciones del anillo del ácido lipoico unido a la Lys-254 de esta subunidad, con apertura (y exposición de 2 grupos ¿SH) cuando la subunidad desarrolla su actividad catalítica, se sigue de glutationilación con glutatión oxidado (GSSG) disponible, que previene la antigenicidad de la región peptídica circundante a Lys-254 si la célula sufre apoptosis. El desarrollo de AMAs en la PBC se ha relacionado con una incapacidad de los colangiocitos para suprimir dicha antigenicidad al tener niveles altos de Bcl2 (que reduce el GSSG, dificultando la glutationilación). Hasta ahora, el único tratamiento aceptado para la PBC consiste en la administración diaria de ácido ursodesoxicólico, una sal biliar que produce una coleresis rica en HCO3¿. Es por ello interesante reseñar que los pacientes con PBC muestran una baja expresión hepática del intercambiador de Cl¿/HCO3¿ AE2 que media la secreción biliar de HCO3¿, y que el ratón knockout para Ae2 muestra características propias de la enfermedad, incluida la presencia de AMAs en suero. En el presente trabajo se utilizaron extractos de hígado total así como colangiocitos en cultivo aislados de ratones de los tres genotipos para Ae2, y se analizaron los niveles de estrés oxidativo, glutatión total y apoptosis en estas muestras, tanto en condiciones basales como tras administración del xenobiótico 3,5-dietoxicarbonil-1,4-dihidrocolidina (DDC). Mediante inmunohistoquímica frente a caspasa 3 activada, se observó que los hígados de ratones knockout mayores de 9 meses presentan apoptosis y ductopenia. Por otro lado, los niveles de glutatión totales fueron inferiores en hígados de ratones heterozigotos y knockout AMA positivos versus los AMA negativos y wildtype. Al estudiar los niveles de glutatión en colangiocitos aislados, se observó que estos eran más bajos en heterozigotos y knockout en comparación a células normales. El análisis de expresión génica de genes incluidos en la vía del glutatión mostró resultados compatibles con una situación de estrés oxidativo tanto en hígado como en colangiocitos en cultivo, indicados por la sobreexpresión del mensajero de glutatión peroxidasa y glutatión sintetasa (sin cambios en glutatión reductasa). Además, se observó un aumento en la proporción de células positivas para el marcaje con dihidroetidio, un detector de especies reactivas de oxígeno, en ambos genotipos deficientes de Ae2. Esta proporción aumentó cuando las células fueron incubadas con el xenobiótico DDC. Por otro lado, se estudió la presencia de apoptosis mediante la detección por citometría de flujo de la actividad de caspasa 3 así como la presencia de anexina V. En ambos casos se observó que basalmente no había diferencia entre genotipos, pero que tras la incubación con DDC, los niveles de apoptosis se incrementaron exclusivamente en el genotipo deficiente de Ae2. De forma interesante, esta sensibilidad ante DDC por parte de los colangiocitos knockout se pudo revertir mediante la adición al medio de glutatión reducido 24 horas antes de la inducción de daño. Todos los datos obtenidos sugieren que la disminución de Ae2 provoca un aumento en el estrés oxidativo de los colangiocitos, que puede hacerlos más sensibles al daño y por tanto más propensos a entrar en apoptosis. Además, los niveles de glutatión disminuidos únicamente en el hígado de los ratones AMA positivos indican una posible relación entre la aparición de AMAs y la depleción de glutatión.