Immunomodulatory aptamers

Resum

En este trabajo se describe la generación y caracterización de aptámeros contra los receptores inmunomoduladores murinos CD28 y CD40, y contra un receptor con función no inmunomoduladora MRP1 (del inglés, Multidrug Resistant Protein 1) 1) Se demuestra la capacidad inmunomoduladora de dos aptámeros anti-CD28. Se ha dedicado mucha inversión en el campo de la inmunoterapia para desarrollar herramientas simples y con capacidad traslacional que pudieran inducir o reducir la tolerancia de linfocitos T dependiendo del contexto inmunológico, por ejemplo parapotenciar el estado de anergia en casos de autoinmunidad o la respuesta especifica frente células tumorales en el caso de la inmunoterapia contra el cáncer. A pesar de que los anticuerpos son la herramienta mas comúnmente usada hasta ahora, sin embargo no es técnicamente sencillo convertir un anticuerpo agonista en antagonista o vice versa. En este trabajo hemos conseguido que los aptámero seleccionados contra CD28 puedan ser utilizados dependiendo del contexto inmunológico como antagonista (bloqueando la señal de CD28) o como agonista (activando la señal) mediante simple dimerización. Demostramos que aptámero agonistas de CD28 incrementan la respuesta inmunológica antitumoral inducida por la vacuna idiotípica en un modelo murino de linfoma aumentando considerablemente la supervivencia de los ratones. 2) Hemos generado un aptámero que se une a la proteína MRP1 que se encarga de expulsar drogas fuera de las células favoreciendo la chimioresistencia y la reaparición del tumor. MRP1 está expresado en células madre de melanoma. con el objetivo de encontrar una diana que pudiera estar expresada en la mayor parte de los tumores y que además se asociara con un fenotipo mas agresivo (Células madre tumorales) se seleccionó mediante una combinación de peptide-HT-SELEX (High-throughput) y Cell-SELEX un aptámero contra el motivo extracelular de la proteína MRP1. Este aptámero se utilizó para aislar una células madre tumorales de la línea de melanoma B16/F10 que mostraron tener un fenotipo tumoral más agresivo y un perfil de resistencia a quimioterapia más elevado. El aptámero de MRP1 se usó para generar un nuevo aptámero biespecífico contra MRP1 y CD28 que a su vez se utilizó para crear la vacuna CD28Aptvax (Células tumorales irradiadas recubiertas con el aptámero biespecífico). Demostramos también que el uso de dicho aptámero dirige específicamente la coestimulación de CD28 enlinfocitos T a tumores que sobre expresan MRP1 y que en combinación con la vacuna Gvax y el inhibidor de FOXP3 P60 reduce significativamente el volumen tumoral aumentando la supervivencia de los ratones. 3) En esta tesis se describe por primera vez tres construcciones diferentes derivados del aptámero de CD40: a) un agente bloqueante de la señas de CD40; b) un aptámero agonista de CD40 (activador de la señal); y c) una aptmero-shRNA quimera compuesta por el aptámero agonista de CD40 y un shRNA (del inglés, short hairpin RNA) para dirigir la inhibición del NMD (del inglés Nonsense-mediated RNA decay) a células que expresen CD40. Se muestran dos estrategias diferentes para tratar el linfoma de células B bien mediante el bloqueo de CD40 o aumentando la antigenicidad tumoral mediante la inhibición dirigida del NMD. Basándonos en los resultados obtenidos los aptámeros generados contra CD40 podrían usarse para el tratamiento del linfoma de células B.