Estudio de un nuevo modelo de inducción de endometriosis en rata wistar; evolución bajo tratamiento inmunomodulador y repercusión sobre la fertilidad

Resumen

En la actualidad, la endometriosis sigue siendo una enfermedad cuyo diagnóstico, sólo puede confirmarse con la visualización directa de las lesiones endometriósicas. Esto ha dificultado la disponibilidad de estadísticas de incidencia y prevalencia que cuantifiquen el alcance de este padecimiento. Las líneas actuales de investigación, basadas principalmente en la teoría de la menstruación retrógrada, han ido estableciendo los múltiples factores bioquímicos, inmunológicos y moleculares implicados en la fisiopatología de la endometriosis. La endometriosis sigue siendo un desafío diagnóstico y terapéutico por lo que el conocimiento de su fisiopatología es decisivo. Si se toma en cuenta que el implante endometriósico requiere cinco pasos fundamentales (adhesión, invasión, reclutamiento, angiogénesis y proliferación) para desarrollarse, los dos primeros son los procesos que pudieran estudiarse con la perspectiva de encontrar algún factor que facilite su diagnóstico o tratamiento. La invasividad presenta a las metaloproteinasas y sus inhibidores como un campo importante de estudio debido a que su respuesta a estímulos de esteroides sexuales, la expresión de la survivina, inhibidor de la apoptosis, su variabilidad de expresión en diversos tejidos y su estimulación por factores asociados a la inflamación y respuesta inmunológica (MCP1, TNF-α, VEGF) parece conjugar varios factores que se analizaban de manera independiente en cuanto a su relación con la endometriosis. En este caso concreto queremos investigar a todos los factores inmunitarios participantes en la génesis y desarrollo de la endometriosis. Estos dos primeros puntos, adhesión e invasión, son decisivos debido a que incluyen los procesos moleculares, bioquímicos e inmunológicos con los que se inicia el proceso fisiopatológico de la endometriosis. En relación a la infertilidad asociada a la endometriosis influyen, además de la alteración anatómica de la pelvis femenina producida por la fibrosis final de todo proceso endometriósico, que distorsiona la relación anatómica del aparato genital interno femenino, a la citotoxicidad de determinadas citoquinas, que pueden interferir en los mecanismos de transporte de los gametos, unión de los mismos y su implantación, impidiendo la formación y el desarrollo del embrión. En este sentido, hay estudios que demuestran cómo una mujer con endometriosis grado IV, sometida a tratamiento con etanercept (terapia biológica anti-TNF) por una artritis reumatoide, ayudada por las técnicas de reproducción asistida, consiguió quedar gestante tras un primer ciclo de fecundación in vitro (FIV), a pesar de no mejorar su grado de endometriosis. Así como la endometriosis es una enfermedad relativamente frecuente en mujeres, en animales es rara. Quizá sea también más difícil de diagnosticar. Teniendo en cuenta la teoría de la menstruación retrógrada, como causa de la endometriosis, en animales este fenómeno es más difícil de producirse, ya que en muchos de ellos existe una bolsa ovárica que facilita la captación ovular y aisla al peritoneo pélvico de los fluidos uterinos. Además la menstruación como tal sólo se produce en primates. En hembras de babuíno, hay descritas inducciones de endometriosis, depositando por laparoscopia el material obtenido inmediatamente antes por legrado. Una vez desarrollada la endometriosis así inducida, ésta mejoraba al administrar anti-TNF. Las monas que por similitud menstrual con la mujer serían modelos animales ideales, presentan el inconveniente de su difícil manejo, un coste económico elevado y escasa disponibilidad. Las conejas dependen del coito para la ovulación, por lo que no resulta un modelo animal idóneo para el estudio de esta patología. Sin embargo la rata Wistar es de fácil manejo, económica y con ciclos poliéstricos cada 4-6 días. El tratamiento actual de la endometriosis persigue tres objetivos: 1.- aliviar el dolor 2.- resolver las lesiones endometriósicas 3.- restablecer la fertilidad. Ante esta perspectiva nos planteamos el siguiente proyecto de investigación “Estudio de un nuevo modelo de inducción de endometriosis en rata Wistar; evolución bajo tratamiento inmunomodulador y repercusión sobre la fertilidad". Si en el mecanismo de inicio o desarrollo de la endometriosis interviene el sistema inmunológico, el tratamiento con inmunomoduladores debería mejorar la evolución de esta enfermedad. Si además se ha observado una mejora de la fertilidad en mujeres con enfermedad endometriósica tratadas con inmunomoduladores por otras causas distintas a la endometriosis, deberíamos poder reproducir una secuencia similar con métodos científicos y documentarla en modelos animales, para poder extrapolar un efecto beneficioso de los fármacos de los cuales se benefician pacientes con patologías inflamatorias diversas. En el desarrollo de la Tesis nos planteamos los siguientes OBJETIVOS: 1- La creación de un nuevo modelo microquirúrgico de inducción de adenomiosis y endometriosis en rata Wistar. 2- El estudio de los mecanismos fisiopatogénicos y de la respuesta inflamatoria de la endometriosis y de la adenomiosis. 3- El estudio de la evolución del implante, cuando sometemos al animal a un tratamiento inmunomodulador. 4- El estudio de la respuesta reproductiva tras el tratamiento con anti-TNF. Para la realización del estudio se han utilizado 84 ratas Wistar-Han, hembras adultas jóvenes, de entre 8-10 semanas de edad, con capacidad reproductora y con un peso comprendido entre los 200-230 gramos y 10 ratas Wistar-Han machos adultos jóvenes, reproductores de 10 semanas de edad, con un peso comprendido entre 280 y 300 gramos. El desarrollo del experimento se llevó a cabo de la siguiente manera: Fase Preliminar: Puesta a punto del modelo microquirúrgico de inducción de endometriosis en rata Wistar Han. Para la realización de esta fase, se utilizaron 12 ratas Wistar-Han hembras de 200-230 gramos de peso y 10 semanas de edad. Todos los animales de este grupo fueron sometidos a inducción microquirúrgica de endometriosis mediante el modelo PGR Hot-Dog capas. Fase de Estudio: Para la realización de esta fase, se utilizaron 72 ratas Wistar-Han hembras de 200-230 gramos de peso y 10 semanas de edad, que fueron divididas de la siguiente forma: Grupo 1: 24 ratas sometidas a una resección, de 7 mm. del cuerno uterino izquierdo, y anastomosis del mismo. La mitad del grupo, GRUPO 1A, 12 ratas, fueron tratadas con el tratamiento inmunomodulador anti TNF (INFIXIMAB) y las 12 restantes, GRUPO 1B, con suero salino fisiológico. A su vez los dos subgrupos A y B se subdividieron de la siguiente manera: 6 ratas se cubrieron con los machos para el estudio de la fertilidad y de las 6 restantes: 3 ratas se sacrificaron a las 4 semanas de haber realizado la intervención microquirúrgica y las otras 3 ratas se sacrificaron a las 6 semanas de haber realizado la intervención microquirúrgica. Grupo 2: 24 ratas sometidas a inducción microquirúrgica de endometriosis mediante el modelo PGR Hot-Dog capas. La mitad de ellas, GRUPO 2A, 12 ratas, fueron tratadas con el inmunomodulador y las 12 restantes, GRUPO 2B, con suero salino fisiológico. A su vez los dos subgrupos A y B, se subdividieron de la siguiente manera: de las 12 ratas sometidos a tratamiento inmunomodulador, 6 ratas se cubrieron con los machos para el estudio de la fertilidad y de las 6 restantes: 3 ratas se sacrificaron a las 4 semanas de haber realizado la intervención microquirúrgica y las otras 3 ratas se sacrificaron a las 6 semanas de haber realizado la intervención microquirúrgica. Grupo 3: 24 ratas sometidas a inducción microquirúrgica de endometriosis mediante el modelo PGR Hot-Dog mucosa. La mitad de ellas, GRUPO 3A, 12 ratas, fueron tratadas con el inmunomodulador y las 12 restantes, GRUPO 3B, con suero salino fisiológico. A su vez los dos subgrupos A y B, se subdividieron de la siguiente manera: de las 12 ratas sometidos a tratamiento inmunomodulador, 6 ratas se cubrieron con los machos y de las 6 restantes: 3 ratas se sacrificaron a las 4 semanas de haber realizado la intervención microquirúrgica y las otras 3 ratas se sacrificaron a las 6 semanas de haber realizado la intervención microquirúrgica. En nuestro modelo experimental hemos encontrado fenómenos adherenciales, vesículas quísticas adheridas al implante y también en la cavidad peritoneal. Estos hallazgos coinciden plenamente con los observados por autores como Quereda, Ortega y Acién entre otros, quienes describieron estos mismos fenómenos en modelos murinos y lagomorfos a los que indujeron endometriosis a través de un trasplante de endometrio en la cavidad peritoneal. Además de estos hallazgos, en nuestro caso se describen lesiones hiperémicas que afectan tanto a la zona del implante como a la bolsa ovárica y al cuerno uterino y bolsa ovárica contralateral. Creemos que estas lesiones pudieran deberse al efecto del líquido estral producido por el implante, inducido por el incremento del Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular responsable de estos mecanismos vasculares. Los fenómenos inflamatorios generados por el implante, hecho que se constata por el incremento del nivel de MCP-1, los observamos en forma de adherencias múltiples a los órganos vecinos, fundamentalmente a la grasa mesometrial y al intestino circundante. Así mismo, la presencia de “vesículas amarillas”, diseminadas por el peritoneo y órganos adyacentes, fue el hallazgo macroscópico que más frecuentemente encontramos. Dichas vesículas están formadas histológicamente por todas las capas del endometrio –mucosa, muscular y serosa- y su contenido es líquido estral. Este hallazgo fue previamente descrito e interpretado por Ortega J. en 1994, en otros modelos de inducción de endometriosis experimental en roedores. Con respecto a los resultados obtenidos de las determinaciones analíticas realizadas en nuestro estudio, hemos encontramos diferencias estadísticamente significativas, entre los valores basales y post-implante; para MCP-1 , TNFα y VEGF. Dado que la endometriosis es una enfermedad multifactorial con un componente inflamatorio importante, es lógico pensar que el resultado de estas citoquinas muestren un incremento tras la realización de la inducción de la endometriosis. Estos datos concuerdan con los hallados en la literatura y con los hallazgos patológicos, y por tanto, hechos que apoyan la presencia de endometriosis inducida en las ratas con el modelo propuesto. Con respecto a la asociación entre fertilidad y enfermedad endometriósica, están descritas alteraciones en el líquido folicular similares a las encontradas en el líquido peritoneal, observándose un aumento de las citoquinas proinflmamatorias. Este hecho disminuye la calidad ovocitaria, explicando así mismo, la disminución de la fertilización. Del mismo modo, se producen estas alteraciones en el útero dificultándose la implantación del embrión bien por alteraciones uterinas propiamente dichas, por la mala calidad del embrión, porque afecte a la función de la trompa o a la capacitación de fertilización del espermatozoide. En nuestro modelo experimental se producen adherencias y fibrosis, aunque no llegan a provocarse obstrucciones que impidan la fecundación del óvulo, tal y como ocurre en la enfermedad endometriósica espontánea. Debido a las particularidades anatómicas de nuestro modelo quirúrgico de inducción de endometriosis, en el que a pesar de que sí que existen fenómenos inflamatorios que provocan adherencias y fibrosis, dichos fenómenos no llegan a producir una obstrucción completa de la luz que se traduzca en una disminución de la fertilidad. Por lo tanto, si en nuestro modelo de inducción de endometriosis se produce una disminución de los valores de fertilidad normales, sería lógico pensar que esta disminución esté asociada al ambiente hostil creado y no a un problema obstructivo puesto que las características de la bolsa ovárica permiten que los óvulos pasen a la trompa y aniden en el útero. Es de destacar que el incremento de la fertilidad en las ratas que recibieron inmunomodulador, incremento que resultó estadísticamente significativo, puede estar influenciado por la acción antiinflamatoria que sobre el ambiente folicular y uterino tiene este tratamiento. Creemos que dicho incremento está estrechamente relacionado con el control que sobre el ambiente inflamatorio produce dicho tratamiento y no por haber provocado alteraciones anatómicas al inducir la enfermedad endometriósica, puesto que en ninguno de los animales de nuestro estudio hemos evidenciado obstrucción en los oviductos, produciéndose la anidación, gestación y parto sin problemas. Tras haber realizado el estudio experimental y constatar resultados con la literatura consultada, podemos extraer las siguientes conclusiones de esta tesis doctoral: 1. El modelo quirúrgico propuesto para el estudio de la endometriosis inducida resulta viable y funcional al comprobarse que responde a las hormonas sexuales producidas por el líquido estral. 2. La respuesta inflamatoria producida por el modelo quirúrgico de endometriosis inducida, se evidencia por un aumento significativo de las citoquinas proinflamatorias en el líquido peritoneal. 3. El tratamiento con anti-TNFproduce un descenso de los niveles de citoquinas proinflamatorias en el líquido peritoneal. 4. El modelo quirúrgico propuesto para el estudio de la endometriosis inducida no provoca obstrucción del cuerno uterino permitiendo la fecundación anidación y gestación. 5. El modelo quirúrgico propuesto para el estudio de la endometriosis inducida produce una disminución de la fertilidad como consecuencia de la reacción inflamatoria. 6. El tratamiento con anti-TNFen los animales sometidos a endometriosis inducida por el modelo propuesto,produce una normalización de los valores de fertilidad.