Estudios de expresión génica en sangre periférica de pacientes con leucemia linfocítica crónica con un microarray de oligonucleótidos

Résumé

La Leucemia Linfocítica Crónica (LLC) es el tipo de leucemia más común en los países occidentales, representando aproximadamente un 24% de todas las leucemias (Jemal, et al., 2003). Esta enfermedad afecta a personas de edad avanzada con una edad media al diagnóstico de 55 años aunque, cada vez se diagnostica en personas más jóvenes. La incidencia es de 1-3 casos por cada 100.000 habitantes y año, siendo la relación hombre:mujer de 1,7:1 (Jemal, et al., 2003). La LLC se caracteriza por la acumulación progresiva de linfocitos B parcialmente diferenciados, de larga vida y funcionalmente incompetentes (Galton, 1966; Dameshek, 1967). Este proceso acumulativo es considerado como el resultado de una desregulación en el mecanismo de muerte celular programada o apoptosis (Rozman y Montserrat, 1995) que, influye decisivamente en la progresión de la enfermedad. El pronóstico y curso clínico de la LLC es extremadamente variable. En algunos pacientes, la enfermedad sigue un curso estable e indolente sin comprometer la esperanza y calidad de vida mientras que, en otros progresa rápidamente y la supervivencia tras el diagnóstico es menor de 2 o 3 años. Aproximadamente en el 50% de los casos, la enfermedad muestra un curso clínico intermedio. Por ello, durante los últimos diez años ha habido un enorme interés en establecer marcadores pronósticos fiables para predecir la evolución de la enfermedad. Sin embargo, hoy por hoy, todavía se necesitan marcadores pronósticos que se confirmen en estudios independientes, preferentemente en ensayos prospectivos, y que puedan analizarse de forma estandarizada. La cuestión esencial es ¿qué marcadores ó combinación ellos deberían de aplicarse en los ensayos clínicos y en la rutina clínica? La tecnología de los microarrays de expresión génica permiten medir simultáneamente la expresión relativa de cientos/miles de genes entre dos grupos de muestras: control y problema. Dado que los perfiles de expresión génica reflejan las funciones y los procesos celulares que están teniendo lugar en el momento de obtención de la muestra, es esperable que la comparación de los patrones de expresión de células sanas y tumorales proporcione nuevos conocimientos sobre los cambios asociados a la disfunción celular tumoral y a cualquier ruta regulatoria concomitante. Por ello, esta tecnología se ha aplicado ampliamente en el estudio de la patogénesis del cáncer, en su clasificación y subclasificación, en la predicción de la respuesta a terapia y en la identificación de nuevas dianas terapéuticas. Hematochip Humano 8K (Nº de acceso en ArrayExpress: AMEXP-336) es un microarray de expresión génica de densidad media desarrollado por la Fundación para el Estudio de la Hematología y la Hemoterapia en Aragón (FEHHA) para el estudio de neoplasias hematológicas con expresión en sangre periférica (Álvarez, et al., 2007). Esta herramienta mide la expresión de 538 implicados en: la biología de las células hematopoyéticas, la proliferación celular, la activación del ciclo celular, la transcripción, la apoptosis, las leucemias, los linfomas y el cáncer en general. La aplicación de esta herramienta en el área de las neoplasias hematológicas ha mostrado resultados prometedores (Álvarez, et al., 2007). Así pues, podría ser una herramienta idónea para el estudio de la LLC en particular con objeto de identificar nuevos marcadores pronósticos ó de confirmar algunos de los ya existentes. Objetivos: Los objetivos planteados para este trabajo son: 1. Desarrollar un protocolo de trabajo optimizado y robusto de procesamiento de las muestras para el análisis de la expresión génica con un microarray de oligonucleótidos de densidad media, Hematochip. 2. Identificar los perfiles de expresión génica de muestras de sangre periférica de pacientes con LLC pertenecientes a grupos con distinto pronóstico en función de algunos de los principales marcadores conocidos de esta enfermedad. Para ello, es necesario: 2.1. Identificar los genes diferencialmente expresados entre individuos con LLC que presentan las siguientes características: a. Genes IgVH no mutados vs genes IgVH mutados. b. Delección 13q vs cariotipo normal. c. Trisomía 12 vs cariotipo normal. d. Expresión de CD38 positiva vs expresión de CD38 negativa. e. Expresión de ZAP-70 positiva vs expresión de ZAP-70 negativa. 2.2. Validar algunos de los genes obtenidos como diferencialmente expresados en el microarray por PCR cuantitativa a tiempo real (RT-PCR). Metodología La metodología necesaria para alcanzar los anteriores objetivos son: 1. Optimización del proceso de obtención de RNA total de las muestras de sangre periférica. 2. Optimización de las etapas que forman parte del proceso de marcaje de las dianas: 2.1. Síntesis de cDNA de cadena sencilla (ss cDNA) por transcripción reversa. 2.2. Síntesis de cDNA de cadena doble (ds cDNA). 2.3. Síntesis y amplificación de cRNA biotinilado por Transcripción In Vitro (IVT) 3. Fragmentación de cRNA biotinilado. 4. Hibridación, tinción y lavados de las dianas marcadas con Hematochip en la estación automática de hibridación Ventana Discovery. 5. Lectura de los biochips hibridados. 6. Análisis de los datos con R para identificar los genes diferencialmente expresados entre los grupos comparados de muestras. 7. Validar los resultados de expresión génica por RT-PCR.