Design and validation of advanced image analysis tools for the quantification of cancer cell migration in microfluidic

Resumen

Esta tesis presenta el diseño y la validación de herramientas avanzadas de análisis de imagen y de aprendizaje automático para el análisis cuantitativo de la migración tridimensional (3D) de células de cáncer de pulmón. Estas herramientas se utilizaron para estudiar el papel que tiene la composición y las propiedades morfológicas y mecánicas del microambiente en la migración de células cancerígenas. Los experimentos de migración celular se llevaron a cabo usando modelos celulares in vitro consistentes en dispositivos microfluídicos hechos a medida, los cuales proporcionan un alto nivel de control de las propiedades del microambiente, ofrecen propiedades óptimas para la observación microscópica y aseguran el uso apropiado de reactivos debido a sus dimensiones microscópicas. Las diferentes condiciones ambientales de la migración se simularon embebiendo las células en hidrogeles biomiméticos de diferente composición y, por lo tanto, con diferentes propiedades morfológicas y mecánicas. Estos hidrogeles actúan como la matriz extracelular 3D (MEC) de las células. En concreto, se han utilizado hidrogeles hechos de colágeno puro tipo I para simular el tejido conectivo normal e hidrogeles de una composición mixta de colágeno y Matrigel para simular la membrana basal desorganizada en el frente de invasión del cáncer. Los experimentos de migración realizados dentro de los hidrogeles se realizaron con y sin estimulación con suero para determinar el papel de los factores de crecimiento extrínsecos e intrínsecos del hidrogel en la migración celular. Además, se realizaron experimentos de migración con y sin bloqueo de integrinas celulares para determinar el papel de las interacciones célula-MEC en la migración celular, y con y sin inhibidores de metaloproteinasas (MMP) para comprender el papel de la MEC en la migración celular. Los experimentos de migración se realizaron en dos niveles de resolución. Por una parte, se realizaron experimentos a baja resolución para determinar globalmente el efecto de los parámetros analizados en la dinámica de la migración de células cancerígenas. Esto requirió detectar y seguir un gran número de células cancerígenas, con imágenes de baja magnificación (10×) utilizando microscopía de contraste de fase y de fluorescencia de campo amplio. Por otra parte, se realizaron experimentos de migración a alta magnificación (63×) para estudiar la morfología de las células cancerígenas mientras migran, midiendo el número, longitud y tiempo de vida de las protrusiones celulares producidas durante la migración. Esto requirió el uso de microscopía confocal de barrido láser. Las secuencias de microscopía de lapso de tiempo generadas en ambos tipos de experimentos se analizaron utilizando novedosas técnicas de procesamiento de imagen y de aprendizaje automático para obtener métricas cuantificables robustas de la dinámica de la migración celular y del fenotipo de migración en entornos 3D. Esta tesis describe los experimentos realizados junto con los algoritmos computacionales y de procesamiento de imagen utilizados para analizar la migración celular en imágenes de baja y alta magnificación. Proporcionamos el código fuente del software de análisis desarrollado para su uso y futura mejora algorítmica por parte de la comunidad investigadora.