Proteínas quimera de los dominios SH3 de la c-Src y Fyn tirosina quinasaun estudio de las bases moleculares del entrecruzamiento tridimensional de dominios

Resumen

El objetivo de esta Tesis doctoral es estudiar las bases moleculares de los plegamientos alternativos que sufren algunas proteínas. Aunque hipotéticamente el plegamiento de las proteínas esté encriptado en su secuencia primaria, alcanzando un único plegamiento con el cual son funcionales, hay numerosas proteínas donde se han descrito plegamientos alternativos como el entrecruzamiento tridimensional de dominios o la formación de fibras amiloides. En esta Tesis abordamos este estudio a través de pequeños dominios modulares como el dominio SH3 de la c-Src y la Fyn tirosina quinasas. El primero de estos dominios SH3 posee ciertas características que lo hacen adecuado para ser utilizado como modelo para llevar a cabo estudios de este tipo, ya que sufre ambos procesos de plegamiento alternativo. Por otra parte, estos pequeños dominios modulares son perfectos modelos para los estudios de plegamiento ya que son relativamente sencillos de purificar mediante técnicas convencionales, carecen de puentes disulfuro, están formados por unos 60 aminoácidos y han sido ampliamente estudiados desde el punto de vista de plegamiento. El segundo dominio SH3 elegido para este estudio presenta una muy alta similaridad secuencial con el dominio c-Src, aproximadamente el 80 %, pero al contrario de este no forma ni dímeros entrecruzados ni fibras amiloides, al menos hasta la fecha. Por este motivo, se ha trabajado tanto con las proteínas nativas como con distintas quimeras de los dominios SH3 c-Src y Fyn, de manera que los lazos n-Src, RT y ambos de la c-Src han sido intercambiados por los de la Fyn-SH3 y viceversa. También se ha estudiado el efecto que producen ciertas mutaciones puntuales en el sitio de nucleación de ambos dominios SH3 y su influencia en su estructura y estabilidad. Tras exponer una introducción de los antecedentes bibliográficos y las metodologías y materiales usados, esta Tesis se compone de cuatro capítulos, en los cuales se describen tanto los resultados como la discusión de los mismos. De esta forma el primer capítulo que recoge los estudios de esta Tesis, el capítulo 3, está centrado en el estudio y análisis de la influencia del motivo ATCUN situado en el extremo amino terminal de la proteína c-Src-SH3. Los primeros experimentos de nuestro grupo de investigación BIO-328: Estructura de Proteínas con el dominio c-Src-SH3 se realizaron con proteínas clonadas por el grupo de investigación FQM171: Biofísica y biotecnología molecular de la Universidad de Granada. Esta proteína contenía un sitio de corte para la proteasa trombina con el fin de eliminar la cola de seis histidinas situada en el extremo amino terminal de la misma. Como resultado del corte, en dicho extremo quedaba la secuencia de aminoácidos Gly81-Ser82-His83 capaz de interaccionar con metales divalentes como el níquel. Esto se puso en evidencia en algunas de las estructuras del dominio en las cuales tanto níquel como cobre aparecían unidos al extremo amino terminal del dominio SH3 de la c-Src. Por lo tanto, el estudio que se describe en este capítulo pretendía analizar la influencia del motivo ATCUN en los resultados de caracterización biofísica y estructural de la proteína. Para ello, se clonó de nuevo la proteína c-Src-SH3 con un sitio de escisión para la cola de histidinas específica para la proteasa TEV, que permite obtener la proteína sin aminoácidos adicionales en la secuencia. Se ha comprobado que el motivo ATCUN aumenta la solubilidad y que, además, la unión de metales al motivo incrementa la estabilidad del dominio c-Src-SH3. En los capítulos 4 y 5 se describen las proteínas diseñadas para abordar los estudios de la Tesis, centrándose el capítulo 4 en la c-Src-SH3 y sus quimeras/mutantes: SF-Src, SF-Src-Q128E, SF-Src-EAR, SF-RT, SF-2X, Src-L100I, Src-E106D, Src-S123T, Src-T125S, Src-T126S y Src-Q128E. El capítulo 5 se centra en cambio en la Fyn-SH3, en su mutante Fyn-E129Q y en las quimeras: FS-Src, FS-Src-LAH, FS-Src-E129Q, FS-RT y FS-2X. En ambos capítulos se muestra la caracterización biofísica de las proteínas objeto de estudio para determinar tanto su estabilidad química frente al pH y al agente caotrópico cloruro de guanidinio como su estabilidad térmica, realizada mediante las técnicas de fluorescencia y dicroísmo circular. Además, se describen en detalle las estructuras cristalográficas obtenidas mediante difracción de rayos X. En la discusión de estos capítulos se analizan los posibles factores que afectan en el proceso del entrecruzamiento tridimensional de dominios, así como las interacciones más características que influyen en la estabilidad de las proteínas. Por último, en el capítulo 6 se aborda la formación de las fibras amiloides en los dominios SH3 de la c-Src y la Fyn utilizando como agente inductor el cosolvente 2,2,2-trifluoroetanol. También se ha analizado el comportamiento y las transiciones conformaciones de la c-Src-SH3, tanto con el motivo ATCUN como sin él, en presencia del 2,2,2-trifluoroetanol utilizando dicroísmo circular y fluorescencia.