NOVEL TARGETED POLYAMIDOAMINE (PAMAM) NANOCARRIERS FOR GENE DELIVERYDESIGN, DEVELOPMENT AND EVALUATION

Resumen

En este trabajo se han diseñado y evaluado diferentes formulaciones dirigidas con el objetivo de mejorar la liberación de genes en células cancerígenas in vitro e in vivo. Todos los nanosistemas están basados en el dendrímero catiónico PAMAM, al cual se han añadido cuatro ligandos diferentes: ácido hialurónico (AH), transferrina (Tf) y los péptidos B6 y GE11, para evaluar la capacidad de direccionamiento de cada vector. En primer lugar se sintetizó un nuevo conjugado PAMAM-ácido hialurónico (P-AH) mediante la formación de un enlace amina entre el PAMAM y el ácido hialurónico oxidado. Este conjugado fue capaz de formar partículas en presencia de ADN plasmídico (ADNp), mostró una excelente capacidad para la unión efectiva del ADNp y de protegerlo de la degradación por nucleasas. La evaluación in vitro de los complejos P-AH mostró un incremento de la actividad de transfección en células MDA-MB-231 y B16F10 en comparación con los complejos no dirigidos. Además, mediante un ensayo de competición en presencia de un exceso de AH libre, se confirmó la captación mediante un mecanismo mediado por receptor específico. Los estudios de toxicidad mostraron una buena viabilidad celular y menos toxicidad que los poliplejos de PEI. Los resultados in vivo señalaron un incremento de la expresión de la luciferasa en el hígado y corazón de ratones Balb-C comparados con los complejos no dirigidos. Este sistema fue también capaz de transfectar de forma eficiente tumores B16F10 inducidos en ratones C57BL/6, aunque no se observaron diferencias significativas en comparación con los complejos no dirigidos. En segundo lugar, se prepararon y evaluaron unos complejos formulados con diferentes porcentajes del conjugado PAMAM-Tf. La evaluación in vitro de estas nuevas formulaciones dirigidas, preparadas a N/P ratio 6, mostró un incremento en la transfección en células cancerígenas (HeLa, HepG2 y CT26). La toxicidad fue menor que la de los poliplejos de PEI y la captación por endocitosis mediada por receptor fue comprobada mediante un ensayo de competición. Finalmente, se estudiaron los péptidos B6 y GE11 como ligandos de direccionamiento para la liberación de siRNA en presencia de PEG (2 kDa). Los dendriplejos formulados con los conjugados PAMAM-PEG-B6 y PAMAM-PEG-GE11 formaron nanopartículas estables, capaces de condensar de forma efectiva el siRNA. La evaluación in vitro de la capacidad de silenciamiento génico del siRNA encapsulado dentro de los complejos dirigidos con los péptidos B6 y GE11, mostró que el siRNA-Luc específico era capaz de reducir la expresión de luciferasa en células HeLa y LS174, sin dar lugar a efectos tóxicos.