Regulación de los enhancers de los genes de las cadenas δ y ℽ del tcr durante el desarrollo de los timocitos

Résumé

Durante el desarrollo de las células T, los progenitores de células T progresan a través de diferentes poblaciones de timocitos que se distinguen en base a la expresión de los marcadores de superficie CD4 y CD8: timocitos CD4- CD8- (DN), simples positivos inmaduros (ISP) CD8+ en ratón y CD4+ en humanos, timocitos CD4+CD8+ dobles positivos (DP) y CD4+ o CD8+ simples positivos (SP). Los timocitos están expuestos a diferentes señales que hacen posible su desarrollo hacia células T maduras. Los timocitos DN van progresando a través de distintas estadios, DN1 a DN4. Durante las primeras etapas de la maduración de los timocitos, la señalización de Notch promueve el desarrollo de los timocitos DN1 a timocitos DN3a, comprometiendo a estos progenitores hacia el linaje de células T, mientras que la señalización de la interleuquina 7 (IL-7) es esencial para la supervivencia y la protección celular frente a la apoptosis de los timocitos DN2 y DN3a. La generación de los linfocitos Tαβ y Tγδ depende de la recombinación de los segmentos génicos V, (D) y J presentes en los genes Tcra, Tcrb, Tcrg y Tcrd durante el desarrollo de los timocitos, hecho que da lugar a la expresión de receptores de antígenos funcionales, TCRαβ o TCRγδ, en la membrana celular. La recombinación V(D)J de los genes Tcrg y Tcrd se completa en los timocitos DN2 y DN3a, del gen Tcrb en los timocitos DN3a y del gen Tcra en los timocitos DP. Los reordenamientos correctos de los genes Tcrg y Tcrd permiten la expresión de un TCRγδ que induce a la diferenciación de los timocitos DN3a hacia linfocitos Tγδ, en un proceso conocido como selección-γδ. Si tienen lugar reordenamientos exitosos en el gen Tcrb en timocitos DN3a, tiene lugar la expresión de un pre-TCR formado por el ensamblaje de una cadena TCRβ con una cadena invariable denominada pre-Tα. La señalización transducida por el pre-TCR junto a las captadas por los receptores de Notch e IL-7, activan la diferenciación de DN3a a DP, pasando por los estadios DN4 y ISP, en un proceso conocido como selección-β. Los reordenamientos exitosos en el gen Tcra en timocitos DP tienen como consecuencia la expresión de una cadena TCRα que se asocia con la TCRβ previamente expresada para formar un receptor de antígeno TCRαβ. La expresión de un TCRαβ en timocitos DP posibilita los eventos de selección positiva y negativa que permiten la supervivencia de unos pocos timocitos DP que diferenciarán hacia timocitos SP CD4+ y CD8+ para que migren a la periferia como linfocitos Tαβ maduros. Los genes Tcrd y Tcrg muestran programas de desarrollo idénticos que dependen de la actividad de los potenciadores transcripcionales (enhancers) Eδ y Eγ, que están “acti-vados” en timocitos DN2-3a para activar la transcripción y la recombinación V(D)J de los genes no reordenados y “inactivados” en timocitos DP para evitar la transcripción y expresión de las cadenas TCRδ y TCRγ en linfocitos Tαβ. La actividad de Eδ y Eγ de-pende de la unión de factores de transcripción (FT) a sitios de unión para factores de las familias Runx y Myb, que ocurre de forma paralela a la de la señalización de Notch. Du-rante la realización de esta tesis se hemos realizado experimentos de ganancia y pérdida de función de Notch y hemos identificado que la señalización de Notch activa la trans-cripción no codificante (o transcripción germinal) de los genes Tcrd y Tcrg al favorecer el reclutamiento de RUNX1 y MYB a sus enhancers en timocitos DN3a , antes de sufrir la selección-β. Estos resultados indican que la disociación de RUNX1 y MYB de Eδ y Eγ en timocitos DP resulta en la inactivación de estos enhancers y ocurre como conse-cuencia del descenso de la señalización de Notch desencadenada por la señalización del pre-TCR durante la selección-β. Por tanto, nuestros datos revelan el mecanismo molecular del silenciamiento de los genes Tcrd y Tcrg mediado por la selección-β. Además, es-tos resultados revelan un nuevo mecanismo molecular para la regulación génica a través de la señalización de Notch mediado a través del reclutamiento de RUNX1 y MYB a la cromatina de los enhancers que puede ser utilizado en el control transcripcional de otros genes regulados negativamente durante la transición de los timocitos DN3a a DP a través de la selección-β. La señalización del receptor de IL-7 (IL-7R) está mediada por el FT STAT5 y des-empeña un papel clave en procesos tan importantes como la supervivencia de los timoci-tos en sus etapas más tempranas del desarrollo durante los estadios DN y la diferencia-ción de las células T γδ. Este último efecto ocurre a través de la activación de los trans-critos germinales y la recombinación VγJγ del gen Tcrg. En relación a esta señalización, nuestros datos indican que además de ser importante para la regulación del gen Tcrg, tiene una influencia positiva en la actividad de Eδ y en consecuencia en la transcripción del gen Tcrd. En resumen, el trabajo desarrollado en esta tesis doctoral, muestra una regulación común para Eδ y Eγ, dependiente de las señalizaciones mediadas por Notch e IL-7R, a través del reclutamiento de los FT RUNX1, MYB y STAT5 en timocitos DN2 y DN3a, siendo ambos enhancers inhibidos durante la selección-β debido a una drástica bajada de estas señalizaciones, lo que conlleva a la disociación de dichos FT. Estos resultados han revelado el mecanismo molecular para el silenciamiento de los genes Tcrg y Tcrd durante la selección-β y aportan una nueva vía para el control transcripcional mediada por la señalización de Notch a través de la regulación del reclutamiento de estos RUNX1 y MYB a enhancers durante el desarrollo de los timocitos.