Evaluación de una bebida de naranja rica en polifenoles sobre marcadores de síndrome metabólico y riesgo cardiovascular en humanos con obesidad o sobrepeso

Resumen

Antecedentes El sobrepeso y la obesidad son una pandemia mundial. La acumulación de la adiposidad visceral presente en la obesidad ha sido fuertemente asociada con la resistencia a la insulina (RI), la hipertensión, la dislipidemia y el aumento de las tasas de morbilidad y mortalidad. Además, una disminución en factores protectores, tales como la adiponectina, y la desregulación de moléculas inflamatorias podrían conducir a un estado inflamatorio crónico de bajo grado y, más tarde, al síndrome metabólico (SM) (Cañete et al. 2007; Lankinen et al. 2010). La obesidad puede inducir estrés oxidativo sistémico, que se define como un desequilibrio entre las especies reactivas de oxígeno (ROS) y los sistemas de producción antioxidante en el organismo. Los ROS son una variedad de estructuras, que incluyen radicales libres peróxidos, tales como el anión superóxido (O2¿¿), el peróxido de hidrógeno (H2O2), y los radicales hidroxilo (OH -), generados por el metabolismo celular en estado normal y por agentes exógenos que pueden servir como señalización celular o agentes bactericidas. Un exceso en la formación de ROS y/o una capacidad antioxidante deficiente provoca grandes daños en las macromoléculas celulares, tales como los lípidos poliinsaturados, las proteínas y el ácido desoxirribonucleico (ADN) (Castilla-Cortázar 2012). De hecho, la producción de ROS en el tejido adiposo puede producir un aumento en la inflamación, la desregulación de adipocitoquinas y la migración del estrés oxidativo a los tejidos remotos. A través de estos mecanismos, las ROS contribuyen al progreso de la IR, la diabetes o la aterosclerosis y en el desarrollo del SM (Fernández-Sánchez et al. 2011; Rupérez, Gil, y Aguilera 2014). Cuando la obesidad es constante a través del tiempo, existe un desequilibrio en la producción de ROS; en consecuencia, las fuentes de antioxidantes se pueden agotar. El sistema de defensa antioxidante enzimático (E-ADS) incluye, pero no se limita a, la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa y la glutatión peroxidasa (GPX). Por otro lado, existe un sistema de defensa antioxidante no enzimático (NEADS), que en su mayoría ayudar a regenerar el disulfuro de glutatión (GSSG) de nuevo en glutatión (GSH). Las vitaminas antioxidantes como la A, C, E y el ácido alfa lipoico son algunos de estos mecanismos. El ADN, los lípidos, las proteínas y los hidratos de carbono son ejemplos de moléculas que pueden ser modificadas por el exceso de ROS in vivo y con frecuencia son utilizados como biomarcadores. Los F2-isoprostanos (8-iso-PGF2¿) en la orina, el malonaldehído (MDA) y las lipoproteínas de baja densidad oxidadas (oxLDL) en el plasma son ejemplos de biomarcadores de la peroxidación lipídica bastante fiables. Además del efecto citotóxico de la peroxidación lipídica y el daño oxidativo del ADN se produce inmediatamente y constantemente. En los últimos años, la 8-hidroxi-2'deoxiguanosina (8-OHdG) surgió como un marcador fiable de estrés oxidativo en el ADN inducido por las ROS, ya que es un producto principal formado por el ataque de los radicales hidroxilo a la base guanina del ADN. Así mismo, la inflamación ha sido reconocida como un factor de riesgo importante para diversas enfermedades humanas. El aumento de la adiposidad visceral como se presenta en la obesidad, se asocia con una mayor producción de adipocitoquinas proinflamatorias tales como la leptina, y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-¿) y las interleucinas (IL) IL-1, IL-6 y IL-8 (Guzik, Mangalat, y Korbut 2006). La producción descontrolada de estas moléculas forma parte de la patogénesis de la MS (Medzhitov 2008). Por otro lado, los flavonoides son metabolitos secundarios que se pueden encontrar en frutas, verduras y bebidas derivadas de plantas. Estas moléculas poseen propiedades antioxidantes in vitro con y además propiedades farmacológicas tales como antitrombóticos y anti-inflamatorios (Landberg et al. 2011; Kim et al. 2011). Las frutas cítricas contienen aproximadamente 95% de los flavonoides totales, compuestas principalmente por las subclases: flavanonas, flavonas y flavonoles (Bahorun et al. 2012). Particularmente, el zumo de naranja contiene los glucósidos de las flavanonas: hesperidina (200-600 mg/l) y narirutina (15-85 mg/l). Además, el consumo de zumos de cítricos enriquecido en flavanonas se asocia con la disminución de la incidencia en la enfermedad coronaria del corazón, el daño oxidativo del ADN, la concentración de Apo-B (componente principal de LDL-colesterol), oxidabilidad LDL y la mejora de la concentración plasmática de biomarcadores de inflamación y de función vascular (Morand et al. 2011; Sharma et al. 2012; Sharma et al. 2011; Mulvihill et al. 2009; Wilcox et al. 2001; Borradaile, Carroll y Kurowska 1999; Riza et al. 2011; Mida et al. 2005; Jung et al. 2003; Buscemi et al. 2012; Devaraj et al. 2011; Gardana et al. 2007; Giordano et al. 2011). Recientemente, como parte de este trabajo de doctorado, nuestro grupo de investigación desarrolló una revisión sistemática relacionada con compuestos bioactivos en la enfermedad cardiovascular y que ha sido aceptada en la revista Nutrients. En esta revisión, cubrimos varios grupos de polifenoles y se incluyeron 59 trabajos que estudiaban los flavonoides. Sin embargo, con las ecuaciones de búsqueda empleadas no fue posible encontrar publicaciones relacionadas con las flavanonas. Por tanto, creemos que es necesario estudiar en profundidad el efecto de flavanonas en las comorbilidades de riesgo del sobrepeso y la obesidad, tales como parámetros inflamatorios y de estrés oxidativos, así como en los componentes del SM. La metabolómica es un análisis científico que utiliza una estrategia sistemática para el análisis de las huellas bioquímicas presentes en un organismo diana usando tecnologías analíticas innovadoras. Muchos estudios que han utilizado la metabolómica han observado los efectos de ciertos patrones dietéticos o la inclusión de determinados productos de la dieta en la salud y la enfermedad, y a esto se le conoce como nutrimetabolómica (Guertin et al. 2014; Suhre 2014; Schäfer et al. 2014). El descubrimiento de biomarcadores de exposición dietética y la modificación de metabolitos puede servir como herramienta de diagnóstico y por tanto, permitir llevar a cabo acciones preventivas. La posibilidad de descubrir nuevos biomarcadores de consumo de polifenoles representa un enfoque interesante para desentrañar sus efectos protectores en la salud humana. Esos mecanismos de protección implican diversas vías de regulación a nivel molecular/celular, así como propiedades antioxidantes. Es por eso que la metabolómica puede ayudar a identificar las complejas y sutiles influencias en el metabolismo de todo el cuerpo y la fisiología asociadas con el consumo del zumo de naranja. Justificación del estudio El grupo de investigación CTS-461 "Bioquímica de la Nutrición. Implicaciones terapéuticas "desarrolla su investigación en diversas líneas incluyendo: la obesidad infantil y adulta a través de diferentes enfoques que incluyen el estudio de la obesidad a través de novedosos biomarcadores inflamatorios y de estrés oxidativo. El primer objetivo fue comparar el efecto de la suplementación con dos diferentes zumos de naranja enriquecidos con diferentes dosis de polifenoles, en el SM y la enfermedad cardiovascular (ECV) los factores de riesgo, y en los sistemas NEADS y E-ADS, así como en biomarcadores de estrés oxidativo y de inflamación en adultos con sobrepeso y obesidad. Además, se incluyó el uso de la metabolómica con la finalidad de identificar nuevos biomarcadores relacionados con el consumo de zumo de naranja. Objetivos del estudio El principal objetivo fue comparar el efecto de la suplementación con dos zumos de naranja enriquecidos con diferentes dosis de polifenoles: uno con contenido normal (NPJ) (0,6 mg/m L) y otro con un alto contenido (HPJ) (1,5 mg/ml) en factores de riesgo ECV, MS, en el NEADS y E-ADS, así como en biomarcadores de estrés oxidativo en voluntarios con sobrepeso y obesidad. Diseño del estudio Se trata de un estudio con diseño cruzado, aleatorizado, a doble ciego (sujetos e investigadores), con una intervención dietética de 12 semanas y un periodo de lavado intermedio de 7 semanas. Los sujetos fueron asignados aleatoriamente a cada uno de los dos grupos, y fueron emparejados por sexo y edad, mediante un generador de números aleatorios. Los sujetos se dividieron en dos grupos que consumieron dos zumos de naranja con dos concentraciones de polifenoles distintas: i) 0,6 mg/ml, zumo de naranja con un contenido normal de polifenoles (NPJ) y ii) 1,5 mg/ml, un zumo de naranja con alto contenido en polifenoles (HPJ). El primer grupo (n = 54) recibió 2 dosis diarias (250 ml cada una) del HPJ durante 12 semanas (correspondiente a una dosis diaria de 582,5 mg de hesperidina, 125 mg de narirutina y 34 mg de didimina). Después del período de lavado de 7 semanas, los sujetos recibieron el NPJ diario (correspondientes a 237 mg de hesperidina, 45 mg de narirutina y 17 mg de didimina). El segundo grupo (n = 46) recibió el NPJ durante 12 semanas, a continuación de un período de lavado de 7 semanas, después del cual recibieron el HPJ por 12 semanas. Metodología Las muestras de sangre fueron recogidas en ayunas. Después de centrifugar, las muestras de suero se procesaron en el Hospital Virgen de las Nieves para el análisis de parámetros bioquímicos y el plasma se congeló a -80 ° C. El pellet de eritrocitos se lavó y se congeló a -80 ° C para asegurar la lisis. Se tomó la primera orina de la mañana y las alícuotas se almacenaron a -80 ° C hasta su posterior análisis. La presión arterial (sistólica (PAS) y diastólica (PAD), respectivamente) y las mediciones antropométricas se realizaron por métodos estandarizados. Se realizó una medición de adipoquinas y biomarcadores de inflamación y daño endotelial (leptina, IL-1ß, IL-6, IL-8, TNF-¿ y t-PAI1) en plasma. Las mediciones se realizaron utilizando el equipo Luminex 200 a través de la tecnología xMap. Además, los marcadores 8-OHdG, 8-iso-PGF2¿ y oxLDL se midieron por ELISA en orina. La peroxidación lipídica en plasma se analizó utilizando un kit colorimétrico y el MDA usando un kit de ensayo de TBARS. El retinol, tocoferol ¿ y los niveles de ß-caroteno se midieron por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en plasma. El sistema de defensa antioxidante fue evaluado mediante las actividades de la catalasa, SOD, GR y GPX en eritrocitos. La determinación de hesperedina, narirutina y sus metabolitos se realizó utilizando un sistema de cromatografía de líquidos de ultra alta resolución (UHPLC) en muestras de orina. Se utilizó un modelo lineal de efectos mixtos (LMM) para determinar las diferencias entre las intervenciones, con el intercepto como efecto aleatorio y una estructura de covarianza para medidas repetidas por tiempo y la intervención, Las correlaciones entre las concentraciones de los principales flavanonas y variables fueron estimadas por el coeficiente de correlación de Pearson cuando se cumplían los supuestos de normalidad y por el coeficiente de correlación de Spearman cuando no se cumplían los supuestos de normalidad. P <0,05 fue considerado significativo. Además, se seleccionó una sub-muestra de 30 sujetos, con una edad de entre 22-63 años. Los análisis fueron elaborados por Metabolon Inc. (NC, EE.UU.), en suero humano, pareados por edad y sexo. Se tomaron muestras del tiempo basal y final correspondientes al primer brazo del estudio (diseño paralelo). El análisis fue desarrollado utilizando cromatografía liquida de ultra precisión/espectrometría de masas (UPLC-MS/MS) con el modo de ion positivo y negativo, mediante ionización por electrospray, en una plataforma polar de cromatografía liquida (LC), y cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC-MS). Los datos en bruto se extrajeron, los picos fueron identificados y se utilizaron controles de calidad. El procesado de datos se realizó utilizando hardware y el software propietario de Metabolon. Los compuestos fueron identificados por comparación con estándares de la base de datos de Metabolon. Diferentes métodos estadísticos se utilizaron para explorar los datos de metabolómica y en búsqueda de identificar patrones, entre ellos el análisis de componentes principales (PCA) y el análisis de ¿selvas aleatorias¿ (RF). Para el análisis univariante, se llevó a cabo un t-test para muestras independientes para identificar la posible diferencia a tiempo basal entre grupos. Para el análisis de la varianza (ANOVA), tres tipos de efectos se determinaron, el tiempo (basal vs final), tratamiento (NPJ vs HPJ) y la interacción tratamiento x tiempo. Se calculó la tasa de falsos positivos (q) y se estableció un punto de corte < 0.1. Resultados Se resumen los resultados más relevantes del estudio. La ingesta de cualquiera, el NPJ o el HPJ, condujo a una disminución de 8-OHdG en orina, de 8-Iso-PGF2¿, así como las actividades catalasa y GR en eritrocito. También se observó una disminución en el IMC, la circunferencia de la cintura y la leptina (todos p < 0,05) tras 12 semanas con ambos zumos de naranja. Por otro lado, sólo la intervención con el NPJ disminuyó presión arterial sistólica y diastólica. Finalmente, el grupo HPJ mostró un aumento en la actividad de la SOD en eritrocitos. Utilizando el análisis metabolómico, se identificaron seiscientos cincuenta y un metabolitos, 33 correspondiente a la plataforma de GC-MS, 321 correspondiente al modo positivo LC/MS, 221 que corresponde a la LC/MS modo negativo y 76 que corresponde a la LC/MS modo polar. No hubo diferencias significativas entre las intervenciones ni interacción tiempo x intervención. Sin embargo, 79 metabolitos mostraron un efecto tiempo significativo (p ¿ 0,05; q ¿ 0,1). Después de utilizar el modelo PCA, la agrupación no logró identificar patrones metabólicos distintos entre sujetos de los grupos LPJ y HPJ. Sin embargo, cuando se utiliza el análisis de RF, se observó una firma bioquímica diferencial única entre las muestras basales y finales del grupo HPJ. En este caso, la precisión predictiva fue del 97%. Es de interés mencionar que tres de los cinco principales metabolitos encontrados en esta firma metabólica se encuentran relacionados con el consumo de zumo de naranja, siendo estos el metil glucopiranósido (alfa-beta), la estaquidrina y la betonicina. Los principales productos lipoxigenados derivados de ácido linoleico, 9-hidroxi-10,12-octadecadienoico ácido (9-HODE), además del 13-hidroxi-9,11-octadecadienoico ácido (13-HODE) disminuyeron significativamente sólo tras 12 semanas de intervención con el HPJ (FC: 0,50; q = 0,0421). Además, estos metabolitos se correlacionaron con los ácidos-9,10-dihidroxi-octadecenoico (9,10 DiHOME) y 12,13-DiHOME (rho = 0,401; p = 0,028 y rho = 0,449; p = 0,013, respectivamente) y mostraron una correlación inversa con la betonicina (rho = -0,399; p = 0,029) y la naringina (rho = -0,428; p = 0,018). Conclusión En conclusión, nuestros resultados demuestran que el consumo de cualquiera de los dos zumos, protege contra el daño del ADN y la peroxidación lipídica, también se modificaron varias enzimas antioxidantes y se mejoró el peso corporal en adultos no fumadores con sobrepeso u obesidad. Mientras que la presión arterial y la actividad de la SOD se modificaron únicamente tras la ingesta del HPJ. El uso de la metabolómica puede dar una visión más profunda en las intervenciones nutricionales, como hemos comprobado, es posible determinar biomarcadores de consumo de zumo de naranja y de evaluar la validez de la intervención dietética. También es posible ir más allá y determinar los efectos en la salud y en la patología que no son posibles de descubrir con los biomarcadores tradicionales. Por tanto nos puede ayudar a proporcionar un mejor asesoramiento dietético. Es necesario aplicar lo expuesto aquí en una población mayor y validar los resultados obtenidos en la presente tesis. La elucidación de la función específica de cada flavanona y sus mecanismos de acción requiere de más estudios. Fortalezas y limitaciones del estudio. Las siguientes limitaciones deben tenerse en cuenta. Nuestro diseño carecía de un grupo control (placebo) que podría servir para evaluar la comparación de las dos dosis de polifenoles presentadas frente a sujetos exentos de tratamiento. Además, la disminución del IMC podría ser una variable confusora con influencia en nuestros objetivos principales, debido a la relación que tiene esta variable con la obesidad y la inflamación. Asimismo, un factor determinante en los ensayos cruzados es el efecto de arrastre que podría estar relacionado con la fatiga o el corto plazo del periodo de lavado, esto se refleja en una respuesta diferente entre los dos periodos de intervención. En nuestro análisis estadístico, realizamos un ajuste por el índice de masa corporal y se calculó el efecto de arrastre con el fin de gestionar adecuadamente estas limitaciones. En algunos casos, encontramos una interacción significativa (interacción tiempo por tratamiento) que demostró que existía un efecto de arrastre aún después del período de lavado de 7 semanas. Esto podría ser un factor de confusión que evitaría ver los efectos reales en algunos resultados. Por último, dado el pequeño tamaño de muestra empleado en el análisis de metabolómica, los efectos se podrían ver limitados, por tanto, se requiere un mayor tamaño de muestra para confirmar los resultados obtenidos en el presente trabajo. 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