Desarrollo de nuevas estrategias de detección de ácidos nucleicos para diagnóstico molecular

Résumé

El diagnóstico molecular basado en ácidos nucleicos ha mostrado ser de vital importancia en el diagnóstico de enfermedades como el cáncer o enfermedades infecciosas. El desarrollo de sistemas que permitan detectar ácidos nucleicos y que confieran ciertas ventajas sobre los sistemas actualmente disponibles es de gran interés. Con el objeto de aportar nuevos enfoques y contribuir a algunos de estos retos, en esta tesis doctoral se aplican diferentes métodos de detección de ácidos nucleicos. En primer lugar, se integra el marcaje por química dinámica (Dynamic Chemistry Labelling, DCL), basado en el uso de ácidos nucleicos peptídicos (Peptide Nucleic Acids, PNAs) abásicos y SMART-Nucleobases para la lectura de ácidos nucleicos con resolución de una base, junto con nanopartículas de poliestireno, que destacan por su versatilidad y estabilidad. Con este enfoque se estudian variaciones de nucleótido en secuencias sintéticas del oncogén KRAS y miR-122 en fluidos biológicos como plasma humano mediante citometría de flujo. En segundo lugar, se combina la DCL con la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) detectando secuencias α-satélite en líneas tumorales humanas, abriendo la posibilidad de estudiar polimorfismos en estas secuencias y se plantea cómo esta nueva aplicación podría ser utilizada para llevar a cabo secuenciación por química dinámica in situ. Además, se realiza una primera aproximación para detectar mutaciones puntuales en ARN mensajero de KRAS in situ en líneas tumorales humanas. Finalmente, en esta tesis se aplica el método isotermal de amplificación C2CA (Circle-To-Circle Amplification), basado en varias rondas de Rolling Circle Amplification (RCA), para detectar ARN viral del virus del Zika y evaluar la eficacia de dos fármacos antiflavivirales en células sanguíneas periféricas mononucleares infectadas. En definitiva, en esta tesis doctoral se exploran técnicas y métodos con el objeto de aportar nuevos enfoques y mejoras en la detección de ácidos nucleicos para contribuir al diagnóstico molecular.