Efecto antitumoral de las inmuntoxinas anti-tn conjugadas con granulisina

Zusammenfassung

Este grupo de investigación ha venido estudiando por más de dos décadas la granusilina recombinante de 9 KDa (GRNLY), a partir de una colaboración con el laboratorio del Dr. Krensky, descubridor de la molécula. Se demostró la capacidad antitumoral de la GRNLY recombinante en estudios in vitro y en modelos de desarrollo de tumores humanos xenotransplantados en ratones atímicos, mediante administración intratumoral. Posteriormente, se desarrolló una estrategia para direccionar la molécula con miras a el uso sistémico. Como prueba de concepto, se generó en colaboración con la Dra. Laura Sanz una inmunotoxina dirigida contra el antígeno carcino embrionario (CEA) y se demostró su capacidad de direccionar el tratamiento hacia el tumor en un modelo atímico xenotransplantado con células tumorales que expresaban CEA. La GRNLY en solitario no era capaz de detener el crecimiento tumoral por inyeccón sistémica. Más adelante, en colaboración con el Dr. Ramón Hurtado, experto en el estudio de las glicosilaciones proteicas, se desarrollaron dos inmunotoxinas dirigidas contra el antígeno asociado a tumor Tn, encaminadas a su uso sistémico en un número mayor de tumores que la inmunotoxina anti-CEA. El modelo de expresión que usamos fue P .pastoris, que genera proteínas plegadas y glicosiladas que no contienen lipopolisacáricos (LPS), problemas éstos asociados con las proteínas recombinantes producidas en E.coli. Fue necesaria la optimización del protocolo y en ese proceso, el Dr. Javier Raso nos asesoró para mejorar los procesos biotecnológicos asociados y se innovó mediante la técnica de electroporación por campos eléctricos pulsados o PEF. El exitoso proceso incrementó el rendimiento y además se introdujeron protocolos adecuados de estabilización de las inmunotoxinas para su conservación a largo plazo. Inicialmente, se demostró que la fracción scFv de la inmunotoxina mantiene su afinididad por su antígeno purificado o expresado en la superficie de células tumorales. En general, las inmunotoxinas resultaron más citotóxicas sobre las líneas celulares a las que se unía con mayor afinidad la inmunotoxina, debido a una mayor expresión del antígeno Tn. Estudios previos mostraron que la GRNLY actúa mediante activación de la vía intrínseca de la apoptosis y en menor proporción, activación de la vía de la necroptosis y la esfingomielininasa. Se demostró que las inmunotoxinas, aunque también ejercen muerte celular al menos parcialmente a través de mecanismos apoptóticos y necroptóticos, son capaces de activar además un mecanismos necróticos que actúa con mayor rapidez. Gracias a las mejoras al rendimiento de producción de las proteínas, se pudieron realizar los ensayos in vivo en un modelo NUDE xenotransplantado con el adenocarcinoma de páncreas humano CAPAN-2. En este modelo se demostró que las inmunotoxinas SM3GRNLY y AR20.5GRNLY fueron eficientes tras inyección sistémica, disminuyendo el volumen tumoral en un 40 y un 60% respectivamente. En consonancia con el mecanismo apoptótico señalado, los cortes histológicos de tumores derivados de los ratones atímicos mostraron morfología nuclear compatible con apoptosis y marcaje positivo en inmunohistoquímica de Caspasa-3 activada. Un aspecto a considerar acerca de los resultados obtenidos en los modelos atímicos heterólogos es la falta de certeza respecto a la respuesta inmunogénica, debido a que las células inmunitarias, citocinas y matriz extracelular derivan de ratón mientras que el tumor y la granulisina son humanos. En este contexto, como primer acercamiento, se ensayó la GRNLY intratumoral en un modelo murino humanizado, los ratones NOD Rag gamma (NRG) xenotransplantados con la línea de adenocarcinoma de colon humano HT-29. Estos experimentos demostraron que se puede utilizar este modelo para futuros estudios sobre el auténtico potencial inmunogénico de la granulisina y sus inmunotoxinsas. La optimización de los protocolos biotecnológicos y la introducción de la técnica PEF para la producción/purificación de las proteínas recombinantes en el sistema de expresión P. pastoris permite continuar con la investigación de los mecanismos de acción de las inmunotoxinas y trasladar la experimentación a un modelo murino humanizado para corroborar su inmunogenicidad. La patente de las proteínas recombinantes usadas en este estudio fue adquirida por la empresa Peaches Biotech, de modo que esta investigación ha despertado el interés de las empresas farmacéuticas con perspectivas para su uso en humanos.