The mek5/erk5 pathway in lung and ovarian cancer

Resumo

IMPLICACIÓN DE LA RUTA DE MEK5/ERK5 EN CÁNCER DE PULMÓN Para responder a la pregunta de si la vía de señalización de MEK5/ERK5 promueve el desarrollo de procesos tumorigénicos, generamos ratones transgénicos diseñados para expresar una forma constitutivamente activa de MEK5. En el trabajo presentado en esta tesis doctoral mostramos que un 46.47% de estos animales desarrollaron tumores de pulmón con características indistinguibles de los adenocarcinomas de pulmón humano (positivos para los marcadores inmunohistoquímicos napsina-A, Ck7 y TTF-1). Los adenocarcinomas pulmonares, que fueron desarrollados tanto por machos como por hembras de los dos linajes transgénicos generados, presentaban además una mayor activación y expresión de ERK5 que los pulmones sanos de ratones no transgénicos. Estos resultados tenían correspondencia en humanos ya que los análisis de adenocarcinomas de pulmón humanos obtenidos de pacientes del Hospital Universitario de Salamanca mostraron una activación constitutiva y expresión aumentada de MEK5 y su quinasa diana aguas abajo ERK5 en comparación con tejido pulmonar no tumoral. El descubrimiento de que la activación de la ruta MEK5/ERK5 actuó patofisiológicamente en el cáncer de pulmón en ratones, junto con la necesidad de desarrollar terapias novedosas para esa enfermedad, estimuló estudios adicionales dirigidos a explorar la relevancia pronóstica de la expresión de MEK5/ERK5 en los tumores de pulmón, así como el potencial valor terapéutico de su inhibición. Para abordar los análisis de correlación entre los niveles de expresión de estas quinasas y la supervivencia de los pacientes de cáncer de pulmón utilizamos las bases de datos KM-plotter y cBioportal, los cuales revelaron que tanto la amplificación génica de MEK5/ERK5 como unos niveles elevados de su ARNm se asocian a una peor tasa de supervivencia a la enfermedad. Esto fue observado a nivel de supervivencia global y supervivencia post-progresión tanto para pacientes fumadores como no fumadores con cáncer de pulmón del subtipo adenocarcinoma; pero no para aquellos correspondientes al subtipo escamoso. Además, análisis realizados in silico con estas bases de datos nos permitieron comprobar que menos del 1% de los pacientes con cáncer de pulmón presentan mutaciones en MEK5 o ERK5, lo cual se corresponde con la ausencia de mutaciones detectada en los análisis de secuenciación de diversas líneas celulares de cáncer de pulmón. El hecho de que tanto los análisis bioquímicos por Western blotting como los análisis inmunohistoquímicos o por inmunofluorescencia del tejido tumoral humano y de las líneas celulares demostraran una activación constitutiva de la vía, nos empujó a hacer uso de herramientas farmacológicas y genéticas en líneas celulares de cáncer de pulmón y en tumores xenoinyectados en modelos murinos para evaluar el potencial terapéutico de bloquear esta ruta como una estrategia novedosa para combatir el cáncer de pulmón. Así, tanto el silenciamiento génico de MEK5 y ERK5 mediante shRNA como la total eliminación de estas quinasas mediante la tecnología CRISPR/Cas9 consiguió reducir significativamente la proliferación de distintas líneas celulares correspondientes a varios subtipos de cáncer de pulmón. El bloqueo de la actividad de la ruta empleando fármacos inhibidores de MEK5 (BIX02189) o ERK5 (JWG0-71) consiguió un efecto similar, reduciendo de una manera dosis-dependiente la proliferación de dichas líneas celulares. Estos mismos resultados fueron observados in vivo, donde los ratones xenoinyectados con células de cáncer de pulmón carentes de ERK5 o MEK5 desarrollaron tumores cuyo crecimiento fue mucho menor que el observado con las células control. De la misma manera, el crecimiento de estos tumores se veía claramente comprometido por el tratamiento con los inhibidores farmacológicos de MEK5 y ERK5 anteriormente mencionados. Con ensayos de análisis de apoptosis y perfil de ciclo celular descubrimos además que el efecto antiproliferativo de la inhibición de la vía no estaba causado por un incremento de la muerte celular sino por una ralentización del progreso a lo largo del ciclo celular. Debido a que una gran parte de los regímenes de tratamiento en diversas neoplasias se basa en la combinación de fármacos, decidimos en último lugar evaluar si el bloqueo de la actividad de la vía de MEK5/ERK5 podría potenciar el efecto antitumoral de diversos compuestos aprobados en la clínica del cáncer de pulmón. Dichos análisis revelaron que tanto la inhibición génica de ERK5 como la inhibición farmacológica de la vía mediante BIX02189 y JWG-071 consigue aumentar la acción terapéutica del agente quimioterápico cisplatino. Dicho efecto fue observado in vitro e in vivo. IMPLICACIÓN DE LA RUTA DE MEK5/ERK5 EN CÁNCER DE OVARIO Con el propósito de descubrir nuevos agentes patofisiológicos en el cáncer de ovario, inicialmente utilizamos arrays de anticuerpos para analizar el estado de fosforilación de varias proteínas que se utilizan como marcadores de la actividad de distintas vías de señalización. Estos ensayos, realizados sobre cuatro líneas celulares de distintos subtipos de carcinoma epitelial de ovario demostraron que las proteínas WNK1 y ERK1/2 presentaban unos niveles de activación diferenciales. Por este motivo, decidimos evaluar su estado de activación en muestras tumorales obtenidas a partir de pacientes del Hospital Universitario de Salamanca. Dichos análisis revelaron que hay una gran variabilidad entre los niveles de activación de distintos subtipos tumorales y también de los pacientes pertenecientes a un mismo tipo tumoral, pero lo más destacable es que unos mayores niveles de activación de WNK1 y de ERK1/2 se asocian con una peor tasa de supervivencia global a la enfermedad. Estos datos fueron corroborados en estudios in silico a partir de las bases de datos Firebrowse, cBioportal y KM-plotter, a partir de las cuales pudimos observar que el gen que codifica WNK1 se encuentra en una de las localizaciones cromosómicas más frecuentemente amplificadas en los tumores de ovario. De hecho, la amplificación de WNK1 correlaciona con unos mayores niveles de expresión de su correspondiente ARNm y, a su vez, unos mayores niveles de ARNm de WNK1 correlacionan con una peor tasa de supervivencia a la enfermedad. Debido a que WNK1 es reconocida como la quinasa activadora aguas arriba de la ruta de MEKK2-MEK5-ERK5, evaluamos también si una asociación similar se observaría con el resto de miembros de la vía, encontrando que unos niveles elevados de expresión de dichas proteínas sí correlacionan con una peor supervivencia libre de progresión y supervivencia post-progresión a la enfermedad; aunque no con su supervivencia global. Posteriormente evaluamos el potencial terapéutico de la inhibición de esta ruta de señalización. Estudios de inhibición genética mediante shRNA de cada uno de los componentes de la vía, así como ensayos de eliminación génica de MEK5 mediante CRISPR/Cas9 demostraron que el bloqueo de esta vía reduce la tasa de proliferación de distintas líneas celulares de cáncer de ovario in vitro e in vivo. Además, la inhibición farmacológica de WNK1 (mediante el compuesto WNK463) o MEK5 (mediante BIX02189) consigue un efecto antiproliferativo similar. En análisis posteriores mostramos que, de forma muy relevante, la inhibición de la ruta de ERK1/2 mediante el fármaco trametinib (que actualmente se encuentra en fase III de desarrollo en ensayos clínicos mostrando resultados muy esperanzadores) provoca la activación de la ruta ERK5, y esto dificulta su efecto antiproliferativo. El hallazgo de este mecanismo de señalización compensatoria fomentó la subsiguiente utilización de tratamientos de combinación para inhibir simultáneamente ambas vías, y eso dio como resultado un efecto antiproliferativo mayor que el logrado por el bloqueo individual de cada una de estas rutas. Además, los experimentos in vitro e in vivo, complementados con tecnología que utiliza cultivos 3D derivados de plasma humano (HuP3D) con biopsias de tumores primarios de ovario, apuntan a un beneficio clínico cuando se combina el bloqueo de ambas rutas al realizar un tratamiento simultáneo con BIX02189 y trametinib. Dado el interés clínico en el uso de inhibidores de ERK1/2, nuestros datos indican que para lograr un efecto antitumoral óptimo, se debe tener en cuenta el mecanismo de escape relacionado con la activación de la ruta ERK5.