El splicing alternativo en el glioblastoma multiformeestudio y caracterización del splicing aberrante del gen BAF45d en la patogénesis del glioblastoma

Resum

INTRODUCCIÓN: El glioblastoma multiforme (GBM) constituye el tumor primario maligno más frecuente y uno de los tumores con peor pronóstico con una mediana de supervivencia entre los 14 y los 18 meses en función de las series. Se trata además de un tumor con una gran heterogeneidad génica y proteica donde la mutación más prevalente (amplificación del EGFR) apenas alcanza el 45% de los pacientes. Uno de los mecanismos reconocidos hoy en día como fundamental en la regulación de la expresión génica y que apenas se ha estudiado en el GBM es el splicing alternativo (AS).El splicing alternativo hace referencia a la distintas combinaciones de los exones de un gen para generar distintas isoformas de RNA maduro y por tanto también de proteína. La regulación del splicing se realiza a través de un complejo macromolecular denominado spliceosoma.Una de las proteínas más importantes de este complejo especialmente por su papel en la regulación del splicing en el GBM es la PTBP1. Los precedentes publicados en la literatura hasta la fecha sobre el AS y el GBM se circunscriben a dos trabajos donde realizan un análisis global del splicing a través de un exónarray.Los genes identificados con un AS en los dos trabajos no coincidieron entre sí, ni con los genes que identificamos con nuestro array. Una diferencia metodológica fundamental con nuestro estudio es que utilizamos un array específico de splicing y no un exón array. El primero incorpora además de las sondas que hibridan específicamente contra los exones sondas que hibridan con las uniones entre estos, de forma que la exclusión del exón, típica en el splicing, se identifica no sólo con la ausencia de la sonda que hibrida contra dicho exón si no también contra la unión de los exones que flanquean al excluido.El array de splicing añade especificidad a los resultados y nuestro proyecto es el primero que realiza un análisis global de splicing con este array. RESULTADOS: En primer lugar observamos diferencias en el splicing tras el análisis global de un array de splicing sobre 3 muestras pareadas de GBM (tumor/no tumor), muestras obtenidas durante la cirugía con la guía de la fluorescencia del 5-Ala. Obtuvimos una lista de 51 genes con un AS significativamente distinto entre las dos condiciones. De los genes que presentaron un splicing significativamente distinto, el gen BAF45d presenta una de las mayores diferencias en la expresión de sus isoformas de RNA entre las dos condiciones así como uno de los mejores grados de validación.El splicing alternativo de BAF45d se produce por la exclusión del exón de 42pb situado en posición 7 (exón 6a) que a nivel de proteína comporta la aparición de dominio de dedo de Zinc o tipo Kruppel responsable de la unión de la proteína a secuencias concretas de DNA. La isoforma que predomina en el GBM es aquella que presenta la exclusión del exón (BAF45d-T). Demostramos como la inhibición de la isoforma BAF45d-T comporta una disminución en la proliferación celular, una disminución en la capacidad de autorrenovación y en la expresión de marcadores de fenotipo indiferenciado in vitro. Objetivamos que la isoforma BAF45d-T está presente en progenitores neurales murinos y disminuye en su diferenciación hacia neuronas maduras. La inhibición completa del gen (shBAF45d) comporta un incremento en la supervivencia en un modelo ortotópico de GBM.En relación a la regulación del splicing comprobamos como la proteína PTBP1 regula el splicing de BAF45d y éste a su vez controla el splicing alternativo a través de su papel regulador directa o indirecta sobre la propia PTBP1. CONCLUSIÓN: En resumen, se describe por primera vez la implicación en la fisiopatogenia del GBM del splicing alternativo de un gen obtenido a partir de una array global de splicing de muestras pareadas.El splicing de BAF45d estaría implicado en la proliferación celular, en el mantenimiento de un estado celular indiferenciado y en la regulación del propio splicing a través de su regulación sobre la PTBP1.