Bioimpedance & dielectrophoresis instrumentation equipments for living cells manipulation and monitoring

Resumen

El objetivo de esta tesis es el diseño de una instrumentación capaz de manipular y caracterizar células, a fin de realizar análisis más exhaustivos de elementos biológicos y acelerar procesos de detección de patógenos para aplicaciones de diagnóstico o de control de calidad de alimentos. El dispositivo se centra en dos tipos de técnicas eléctricas para la manipulación y detección de células: La dielectroforesis (DEP) y la medición de la bioimpedancia. La DEP permite manipular material biológico por medio de campos eléctricos, aprovechando las propiedades eléctricas de la célula y el medio en que se encuentra. La manipulación es por tanto ajustable, mediante el control de estas propiedades, así como a través de la geometría de los electrodos usados, la frecuencia y el módulo de la tensión aplicada. Por otro lado, la IS permite caracterizar material biológico mediante su comportamiento eléctrico en frecuencia. La medida se realiza a través de la aplicación de una corriente alterna controlada y la monitorización del efecto sobre el tejido mediante potencial eléctrico. Los dispositivos de IS son fácilmente integrables con técnicas dielectroforéticas de manipulación, fusionando manipulación con detección. En esta tesis, la combinación de estas técnicas permite la concentración de pequeños patógenos en grandes volúmenes de muestras y su posterior detección. Para ello, se crean diversos módulos de instrumentación electrónica. Algunos, están dedicados a generar señales alternas desfasadas a frecuencias óptimas para la manipulación de patógenos (módulo DEP). Otros, combinan módulos de generación, lectura y tratamiento digital, para la monitorización del comportamiento eléctrico de células (IS). Los módulos diseñados son validados en un entorno real controlado para concentrar y detectar la bacteria Escherichia Coli en grandes volúmenes de agua. Como resultado, se obtiene una electrónica modular válida, autónoma, portátil y de bajo coste, capaz de disminuir tiempos de preparación y detección de muestras en laboratorio. Para el correcto desarrollo del proyecto se definen una serie de objetivos que a su vez definen las diferentes etapas de éste y que devienen en los diferentes capítulos de esta memoria de tesis doctoral. Se definen los siguientes objetivos: a) Demostrar la viabilidad de un generador modular DEP para el control general de células, y en particular de bacterias. Investigar cuáles son las condiciones más óptimas para la manipulación, incluyendo no sólo a nivel de conductividad de medios y protocolo de experimentación, sino también a nivel de señal aplicada. b) Encontrar la mejor opción, a nivel de chip microfluídico, para la preconcentración de bacterias en aplicaciones bioanalíticas. Detectar límites de tasa de flujo para mejorar los tiempos de preconcentrado en laboratorio. c) Verificar la viabilidad del uso de un sistema adaptado para la medición por bioimpedancia por sistema de 4 electrodos tanto para medios fluidos, como tejidos. d) Integrar en un mismo equipo los módulos anteriores para un fin común: diseñar un equipo completo, capaz de beneficiarse de la combinación de ambas técnicas para tener un sistema autónomo que permita manipular y medir células en entornos Lab-on-a-chip. Posteriormente demostrar la capacidad del dispositivo mediante prueba de concepto para el caso real de la concentración de E. coli. En relación al punto a): se exploraron las posibilidades de la dielectroforesis (DEP) y sus aplicaciones. Se analizaron los límites posibles del dispositivo electrónico, en términos de conductividad de la muestra y de la frecuencia aplicada. Para testear el prototipo electrónico, se diseñó un chip microfluídico, compuesto por un electrodo interdigitado y una única cámara de pdms. Se verificó el funcionamiento del dispositivo microfluidico, junto con el equipo electrónico, aplicándolos para un caso de concentración de E. coli. Como resultado, el dispositivo fue capaz de generar señales sinusoidales lo suficientemente estables para manipular E. coli por medio de DEP en el interior del chip microfluídico. Además, se verificó cual era la opción más óptima para concentrar bacterias por medio de 5 casos de test (tabla 1) que obtenían la misma señal efectiva inyectada por medio de la aplicación de distintos gradientes de campo eléctrico. Del análisis de los resultados, se detectó que la mejor combinación para fines de concentración era el uso de señales en contra-fase. En este caso, aplicando 10Vpp por canal, y con una velocidad de flujo de 5 µl / min se obtuvo una mediana del 83% de la eficiencia de concentración Respecto a b): Posteriormente se realizó un estudio a fin de encontrar la mejor opción para aumentar los porcentajes de captura y mejorar las tasas de flujo aplicadas, por medio del análisis del chip microfluídico. Del estudio se verificó que el hasta este punto actual dispositivo microfluiídico, tenía un efecto de atrapamiento en 2D, capturando únicamente en el plano del electrodo y mermando su eficiencia a tasas de flujo elevadas. Por ello, se diseñó un segundo dispositivo microfluídico. Este nuevo dispositivo, basado en polos dieléctricos (tecnología llamada IDEP), era capaz de aumentar considerablemente la eficiencia de atrapamiento sin sacrificar la tasa de flujo aplicada. Un incremento promedio máximo de eficiencia de captura de 12,6% se obtuvo para caudales relativamente altos (20 µL/min). Además, la pérdida de bacterias se redujo en un promedio de 44,2% para 5 µL/min, 10 µL/min y 20 µL/min. Respecto a c): Se trabajó en el diseño de un dispositivo de medición de bioimpedancia que posteriormente se consideró la posibilidad de integrarlo con el equipo DEP. Se definió un primer dispositivo capaz de realizar un amplio barrido en frecuencia. Éste, se testeo en una primera aproximación con diferentes soluciones. El dispositivo fue capaz de medir las diferencias de bioimpedancia de diferentes soluciones de pH y de potasio, utilizando el método de 4 electrodos. Posteriormente, se utilizó el dispositivo en un proyecto europeo en colaboración con el equipo de Nanobioingeniería del IBEC. Para este caso, el dispositivo fue adaptado para leer las señales de una matriz con distintos sensores de pH y de potasio, así como impedancia. La matriz de sensores, junto con el dispositivo, se utilizó para medir la isquemia dentro del estómago de un cero. Por ello, se verificó la capacidad del sensor y el equipo para discriminar diferentes tipos de tejidos. En la figura 3 se puede observar como tejidos magros y adiposos de cerdo son diferenciados por medio de este sistema. Respecto al punto d): Finalmente, se analizó la posibilidad de integrar el módulo bioimpedancia con el de generación DEP y su uso para entornos Lab-on-a-chip. Se diseñó una nueva electrónica autónoma basada en los módulos anteriormente diseñados y teniendo en cuenta que ambos sistemas debían de combinarse en un mismo dispositivo microfluídico. La electrónica fue embebida en un sistema sbRIO (propiedad de National Instruments), que permitía automatizar la aplicación de la DEP, para concentrar las bacterias y controlar la medición en tiempo real de la relación de la impedancia con la cantidad de bacterias concentradas. Se diseñó además, un nuevo dispositivo microfluídico, para facilitar la combinación de ambos sistemas en el mismo chip. Posteriormente se verificó la viabilidad del sistema y su capacidad de concentrar y detectar en tiempo real las bacterias atrapadas en el interior del chip microfluídico. Las pruebas se realizaron a tasas de flujo de hasta 10 µL/ min. Además, para la medición se tuvieron en cuenta los efectos de la variación de la conductividad del medio, problemática que no es habitualmente reportada en los estudios de impedancia sobre bacterias. Se detectó que la mejor frecuencia para la detección de E. coli por IS es 1,7 kHz; donde obtuvimos un error de precisión de menos de 2% y con una correlación de 0,988. Consecuentemente, la combinación de ambas técnicas es posible y útil para reducir largos procedimientos de pre-concentración y detección en laboratorios. Como conclusión, se ha realizado dispositivo final que consigue integrar la técnica DEP y la medida de bioimpedancia en un único dispositivo electrónico autónomo capaz de concentrar E. coli y medir la evolución del volumen de bacteria dentro del chip, en tiempo real. Este estudio abre nuevas vías de investigación, como el desarrollo de nuevas electrónicas con microfluídica integrada para aumentar la portabilidad del dispositivo y así favorecer su uso en entornos point-of-care o en países en vías de desarrollo.