Creación de un modelo animal de incontinencia urinaria de esfuerzo mediante la técnica de electrocauterio de la musculatura parauretral extrínseca sin maniobras de provocación¿

Resumen

INTRODUCCIÓN La prevalencia de la incontinencia urinaria (IU) se estima entre un 5-69% de las mujeres y un 1-39% de los varones. Dentro de este grupo de pacientes, la incontinencia urinaria de esfuerzo (IUE) representa una proporción importante de los mismos. La IUE se debe a una deficiencia esfinteriana que en la mayoría de las ocasiones su etiopatogenia es multifactorial. Para su tratamiento, además de las medidas genéricas conservadoras están descritas múltiples técnicas quirúrgicas. Técnicas de colposuspensión por vía vaginal, vía abdominal o por vía laparoscópica, técnicas de soporte uretral mediante cabestrillo, técnicas de compresión uretral con la inyección submucosa de agentes inertes o mediante la colocación de un esfínter artificial. Pero a pesar de ser éstos unos tratamientos ampliamente utilizados, distan de ser el tratamiento gold estándar de la IUE. A pesar de ser un tratamiento mínimamente invasivo, no está exento de complicaciones. Además de complicaciones menores, aunque con menor frecuencia, también ocurren complicaciones mayores que precisan, en la mayoría de las ocasiones, cirugía reconstructiva adicional para su resolución. Debido a las limitaciones del tratamiento quirúrgico actual han sido investigadas otras modalidades de tratamiento. La terapia celular representa una alternativa de tratamiento emergente dentro del campo de la medicina regenerativa. Así pues, para un mejor entendimiento de la fisiopatología de la IUE y el estudio preclínico de nuevos tratamientos experimentales basados en la terapia de regeneración de los tejidos con células madre, es necesaria la creación de un modelo animal de incontinencia caracterizado por su fiabilidad, reproducibilidad y estabilidad en el tiempo. OBJETIVOS Objetivo principal: 1. Desarrollo de un modelo animal de incontinencia urinaria de esfuerzo con ratas hembra de la especie Wistar mediante la técnica quirúrgica de electrocauterio de la musculatura parauretral extrínseca. Objetivos secundarios: 1. Estudio de la repercusión de la técnica de electrocauterio de la musculatura parauretral extrínseca en la capacidad vesical en ratas hembra de la especie Wistar. 2. Análisis de las complicaciones quirúrgicas asociadas a la técnica de incontinencia urinaria de esfuerzo mediante el electrocauterio de la musculatura parauretral extrínseca en ratas de la especie Wistar. 3. Estimación del número de intervenciones mínimas necesarias en ratas hembra de la especie Wistar para completar la curva de aprendizaje de la técnica quirúrgica de electrocauterio de la musculatura parauretral extrínseca. 4. Evaluación funcional e histológica inicial del uso de células madre derivadas de tejido adiposo adulto como tratamiento de la incontinencia urinaria de esfuerzo en nuestro modelo animal. MATERIAL Y MÉTODOS Material: - Animales: 40 ratas hembra ¿Sprague-Dawley¿ (S-D) de 250 gr, instrumental para microcirugía y anestesia y estabulario. - Estudio Urodinámico en el animal: sistema electrónico para el registro de parámetros urodinámicos y programa informático - Células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC). - Estudio Anatomopatológico Método de la experimentación animal (resumen del procedimiento genérico): Se prepararán ratas incontinentes mediante la técnica de electro-cauterización del esfínter urinario externo. Previo a la intervención, se mide y se registran tres veces consecutivas, el punto de fuga vesical. Una semana después de la creación de la incontinencia urinaria de esfuerzo en el modelo animal, se mide y se registran tres veces consecutivas, el punto de fuga vesical. Luego se procede al tratamiento de la lesión con la utilización de terapia celular. Pasados 30 del tratamiento, se miden y se registran tres veces consecutivas, el punto de fuga vesical. Planificación de trabajo: - Fase I: diseño y desarrollo de la técnica de lesión esfinteriana en el modelo animal, evaluación urodinámica y estudio preliminar de su tratamiento con la inyección de células madre adultas derivadas de tejido adiposo de rata: el objetivo principal de esta fase fue diseñar y desarrollar la técnica quirúrgica bajo visión microscópica para realizar la lesión de la musculatura parauretral extrínseca en el modelo animal. - Fase II: desarrollo y perfeccionamiento de la técnica de lesión esfinteriana en el modelo animal, evaluación urodinámica y estudio preliminar de su tratamiento con la inyección de células madre adultas derivadas de tejido adiposo de rata: el objetivo principal de esta fase fue perfeccionar la técnica microquirúrgica en el modelo animal. - Fase III: Realización de la técnica de lesión esfinteriana en el modelo animal, evaluación urodinámica y estudio preliminar de su tratamiento con células madre adultas derivadas de tejido adiposo humano y scaffold: el objetivo principal de esta fase fue comprobar la presencia de células madre derivadas de tejido adiposo de humano a tiempos cortos de seguimiento y observar las diferencias inducidas por la presencia de las células madre heterólogas. - Fase IV: Realización de la técnica de lesión esfinteriana en el modelo animal y creación de un grupo control, evaluación urodinámica y estudio preliminar de su tratamiento con células madre adultas derivadas de tejido adiposo humano y scaffold: los objetivos de esta fase fueron crear un grupo control de animales para la técnica quirúrgica de incontinencia urinaria de esfuerzo en el modelo animal y comprobar la presencia de células madre derivadas de tejido adiposo de humano a los 30 días de seguimiento, así como observar las diferencias inducidas por la presencia de las mismas en el tejido implantado. RESULTADOS Tras la lesión de la musculatura parauretral extrínseca con electrocauterio, el estudio anatomopatológico con microscopía óptica mediante la tinción de hematoxilina/eosina reveló un músculo lesionado con alteraciones estructurales en la citoarquitectura de la fibra muscular estriada, observando algunos infiltrados celulares que podrían corresponder a polimorfonucleados y fibroblastos. De los 40 animales incluidos en el trabajo de investigación, fueron válidos para la realización del estudio urodinámico 35 (87,5%). Se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas en el PPF vesical medio antes y después del electrocauterio de la musculatura en los dos últimos grupos de experimentación, observándose una disminución significativa del parámetro a estudio. La capacidad vesical no se modifica tras la intervención. De acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio, y considerando como resultado óptimo de la técnica quirúrgica la demostración de cambios urodinámicos estadísticamente significativos en el parámetro de punto de presión de fuga (PPF) vesical medio, la intervención de 20 casos ha permitido alcanzar el objetivo de la técnica aplicada. Las ADSC obtenidas fueron implantadas en cada animal según protocolo establecido mediante la inyección de células madre a ambos lados de la uretra con microjeringa de Hamilton o depositadas sobre scaffold en la musculatura parauretral extrínseca estriada mediante un punto de fijación. Recibieron tratamiento con células madre derivadas de tejido adiposo 17 (42,5%) animales, y 13 (32,5%) fueron grupo control de tratamiento sin ADSC. De las 30 ratas que recibieron algún tipo de tratamiento, en 19 se realizó un estudio urodinámico a los 30 días después del mismo. No existieron diferencias estadísticamente significativas del PPF vesical medio tras el tratamiento de la lesión con células madre derivadas de tejido adiposo. Cuando analizamos la capacidad vesical media tras el tratamiento de la lesión, tampoco se encontraron diferencias estadísticamente significativas respecto a su valor obtenido en el estudio urodinámico realizado previo al tratamiento de la lesión. En total, hubo un 12,5% de complicaciones mayores y un 10% de complicaciones menores. En la Tabla 1 se resumen las complicaciones asociadas a las distintas cirugías según los grupos de tratamiento. Tabla 1. Complicaciones asociadas a las diferentes cirugías. (RAO: retención aguda de orina). Fase n Complicación mayor n (%) Complicacones menores n (%) I 10 Fallecimiento 4 (40) - II 10 Fallecimiento 1 (10) Sangrado leve perivesical 1 (10) Absceso perivesical 1 (10) III 10 - RAO 1 (10) Evisceración 1 (10) IV 10 - - Total 40 5 (12,5) 4 (10) Tras el sacrificio del animal mediante perfusión intracadiaca y fijación del tejido con paraformaldehído, se realizó la exéresis del tracto urinario inferior (vejiga, uretra y musculatura parauretral) y vagina para su posterior estudio histológico detallado. La musculatura parauretral extrínseca de los diferentes grupos experimentales se encontraba con signos histológicos correspondientes a procesos regenerativos tisulares, logrando en la mayoría de las muestras la cicatrización en casi un 100% de la lesión. El análisis microscópico de los tejidos de los diferentes grupos experimentales no mostró diferencias entre ambos grupos de animales: animales con ADSC implantadas mediante jeringa Hamilton y animales con lesión de la musculatura parauretral sin ADSC. Los scaffolds presentaron una coloración rosa intenso con la tinción de hematoxilina/eosina que permitió su distinción del tejido circundante. Se determinó que los scaffolds comenzaron a degradarse a los 30 días de su implantación. En los animales tratados con ADSC y scaffold, se observó a los 6 días de su administración, edema, eritema y la presencia de cicatriz hialina así como una ligera presencia de secreción leucoide, pero sin llegar a ser considerados como exudados purulentos. Para evaluar el grado de integración de las células en los animales donde se administraron, se procedió a realizar la inmunohistoquímica contra núcleos humanos (HuNu). Se encontraron resultados negativos en los animales en los que se administró el tratamiento mediante inyección con jeringa de Hamilton. Al realizar la misma estimación en los animales donde se implantaron membranas de quitosano/alginato con ADSC se encontraron células HuNu positivas a los 3 y 6 días postimplante. Cuando se realizó la inmunofluorescencia contra núcleos humanos a los 30 días postimplante, se pudo observar que el scaffold presentaba autofluorescencia y por otra parte, un pequeño grupo de células humanas localizado próximo al scaffold. Los cortes finos de 80 nm, de las muestras correspondientes a los grupos de animales con scaffolds precargados con ADSCs, fueron observados mediante microscopia electrónica de transmisión (Tecnai Spirit G2, Fei). Se determinó con mayor precisión la capacidad biodegradable del material, ya que 30 días después de la administración, en algunas zonas de la musculatura, el material empezaba a degradarse. Además en las áreas donde se encontraba el material veíamos una cicatrización muy leve a diferencia de las zonas del hilo de sutura. DISCUSIÓN De los diversos tipos de procedimientos descritos para la obtención de un modelo animal de incontinencia urinaria de esfuerzo (IUE), en este estudio hemos tratado de optimizar la técnica descrita por Chermansky et al (CHERMANSKY 2004). Se realizó la electrocauterización de la musculatura parauretral con el fin de simular la lesión que en ocasiones ocurre durante la prostatectomía radical sobre el soporte pelviano del varón. Este modelo animal debía reproducir la lesión de la musculatura pélvica y además ser útil para realizar estudios con células madre y regeneración de los tejidos. Por otro lado, consideramos que se ha realizado una mejora del modelo anteriormente descrito al eliminar las maniobras de provocación durante el estudio urodinámico. Según la definición de la ICS (ABRAMS 2002), la incontinencia urinaria es la manifestación por parte del paciente de un escape de orina. Así pues, el método ideal para evaluar el resultado de una intervención realizada con el fin de provocar incontinencia urinaria de esfuerzo, sería que el sujeto intervenido pudiese expresar la percepción del escape de orina asociado al esfuerzo. Sin embargo, cualquier modelo que utilice animales, como en este estudio, ello no es posible. Tenemos que basar los resultados de la intervención en los datos obtenidos a partir de los parámetros urodinámicos estudiados, concretamente en el punto de presión de fuga vesical, que es una medida indirecta de la resistencia uretral. La medición del punto de presión de fuga (PPF) vesical puede realizarse durante maniobras de provocación de un esfuerzo abdominal (PPF vesical de Valsalva) o sin ellas. En este trabajo se ha utilizado para la evaluación de la técnica quirúrgica y cuantificación del grado de incontinencia alcanzado con ella, el PPF vesical en reposo sin la provocación de maniobras de Valsalva. Consideramos que la medición del PPF vesical de Valsalva tiene ciertas limitaciones en un animal. Estas maniobras no son verdaderas pruebas de esfuerzo ya que, en todas ellas, el animal se encuentra anestesiado. En nuestra opinión, la toma del valor del PPF vesical en reposo ofrece como ventaja en animales sanos en los que no existe una alteración de la distensibilidad vesical, la obtención del valor de la resistencia uretral sin añadir un factor extrínseco no fisiológico que podría alterar los parámetros a estudio. Ambas presiones, el PPF vesical obtenido durante un esfuerzo o en reposo, tienen el mismo significado ya que son una medida indirecta de la resistencia uretral y ésta, una medida objetiva que cuantifica el resultado funcional de la intervención realizada. El análisis prospectivo de las distintas fases del trabajo realizado, permite observar la evolución del mismo en el tiempo. A lo largo de las diferentes etapas, se ha desarrollado el entrenamiento que se precisa en cualquier técnica quirúrgica. De manera que, con los sucesivos procedimientos realizados se adquirieron las habilidades quirúrgicas necesarias para la creación del modelo animal de incontinencia urinaria de esfuerzo. El perfeccionamiento en la técnica quedó reflejado en los resultados obtenidos con las intervenciones realizadas y sus complicaciones asociadas. Esto se demuestra por la disminución importante de las complicaciones mayores. La mortalidad asociada al procedimiento se redujo del 40% en la primera fase al 0% en la última fase de trabajo. Por otro lado, otro hecho que demuestra el refinamiento paulatino del modelo, es que sólo se alcanzaron los resultados significativos con la intervención en las dos últimas fases del proyecto. En nuestra opinión, cuando se realiza experimentación animal se deben diseñar modelos que, como el nuestro, sean fáciles de reproducir y por tanto presenten una curva de aprendizaje corta. Una metodología sencilla del modelo permite reducir el número de animales de experimentación necesarios para conseguir objetivos satisfactorios y por tanto, un ahorro de costes. Paralelamente al desarrollo de nuestro modelo de incontinencia urinaria de esfuerzo animal, hemos sentado las bases de un futuro tratamiento experimental para la incontinencia urinaria de esfuerzo con células madre. En aras de optimizar el número de animales a sacrificar, los cirujanos utilizan los mismos animales para iniciarse tanto en el desarrollo de la técnica quirúrgica de incontinencia urinaria como para realizar el estudio preliminar con terapia celular. En este trabajo hemos utilizado las CM derivadas de tejido adiposo por ser una fuente fácilmente accesible y abundante en CM adultas. Son fenotípicamente similares a las CM derivadas de otros tejidos (ZUK 2002) y con el estímulo adecuado son capaces de diferenciarse en células de linaje osteogénico, adipogénico, condrogénico, miogénico e incluso neurogénico (ZUK 2002). Además, pueden almacenarse con una mínima pérdida de viabilidad. Estas características han convertido a esta estirpe celular en objeto de numerosos estudios, habiendo sido probadas en varios modelos de enfermedad humana. Además, se ha ensayado por primera vez la capacidad regenerativa de células pluripotentes aisladas de grasa humana sembradas sobre un scaffold reabsorbible de quitosano/alginato en un modelo de rata incontinente por electrocauterización. Los datos preliminares de este trabajo sustentan las bases del uso de este modelo de incontinencia urinaria de esfuerzo en ratas para ensayar la capacidad regenerativa de las células humanas sobre un esfínter urinario deficiente. Además, este modelo también permite evaluar las ventajas de una terapia que incluya el uso de un soporte para la localización y acción duradera de las células madre y potenciar así su uso terapéutico en el punto de lesión ya que no se ha identificado reacción de rechazo al biomaterial en el tejido implantado y ha permitido que las células permaneciesen al menos 30 días después de su administración. CONCLUSIONES 1. La lesión mediante electrocauterio de la musculatura parauretral extrínseca de ratas hembra de la especie Wistar origina una disminución del punto de presión de fuga vesical medio 7 días después de la intervención. Esta técnica permite desarrollar un modelo de incontinencia urinaria de esfuerzo. 2. La técnica quirúrgica creada de electrocauterio de la musculatura parauretral extrínseca para el desarrollo de un modelo de incontinencia urinaria de esfuerzo en ratas hembra de especie Wistar no modifica su capacidad vesical. 3. Nuestro modelo animal de incontinencia urinaria de esfuerzo se muestra como una técnica segura, con bajo índice de complicaciones. 4. La curva de aprendizaje estimada para el desarrollo de nuestro modelo animal de incontinencia urinaria de esfuerzo, basada en los resultados urodinámicos obtenidos, es de aproximadamente 20 intervenciones. Este modelo asegura amplia reproductibilidad y aplicación en estudios preclínicos. 5. Las células madre derivadas de tejido adiposo de grasa intraabdominal de humano implantadas sobre los scaffolds para el tratamiento de la incontinencia urinaria de esfuerzo en nuestro modelo animal permanecen en el lugar de lesión hasta 30 días después de su administración sin provocar reacción de rechazo tisular y con menor reacción cicatricial. La funcionalidad de la musculatura lesionada no se restableció a los 30 días de su implantación.