Desarrollo de un sistema de detección de endotoxinas basado en la optimización e implementación de un protocolo de biofuncionalización sobre un biosensor electroquímico de diseño específico

Resum

La sepsis es una de las afecciones más graves causadas por las bacterias Gram-negativas, que se caracteriza por una lesión generalizada del endotelio vascular. Los agentes que originan esta enfermedad son principalmente las endotoxinas presentes en la membrana de las bacterias. El hombre es extremadamente sensible a la presencia de estas toxinas y cantidades mínimas de estas moléculas en la sangre pueden derivar en graves síntomas como anormalidades coagulatorias y fallo multiorgánico. Las endotoxinas son contaminantes habituales en productos farmacéuticos e industriales por lo que es necesario detectar y eliminar todas las trazas de este patógeno en fármacos, sustancias y dispositivos utilizados en complejos hospitalarios o con pacientes inmunodeprimidos. En la actualidad existen diversas técnicas para la detección de endotoxinas, siendo el test LAL la principal de ellas ya que se encuentra validado por las agencias reguladoras. Sin embargo, este método presenta numerosas limitaciones por lo que la implementación de técnicas alternativas de detección de endotoxinas es de suma importancia. En este proyecto se ha desarrollado un sistema electroquímico de detección de endotoxinas basado en microtecnologías y cuyo principio de operación obedece a la detección de pequeñas variaciones de corriente originadas por la presencia de endotoxinas en la muestra. Para ello, en primer lugar, se ha caracterizado y optimizado el biosensor en términos de materiales de fabricación y diseño. En segundo lugar se ha optimizado un protocolo de biofuncionalización basado en la inmovilización de biorreceptores proteicos en la superficie del electrodo de trabajo. Finalmente, se ha validado el sistema tanto para la detección de muestras sintéticas de endotoxinas de concentraciones del orden de los picogramos como para el análisis de muestras reales. Los resultados obtenidos a lo largo de este trabajo confirman la validez de esta técnica para la detección de endotoxinas. Como consecuencia del trabajo de un equipo multidisciplinar se ha diseñado, fabricado y validado un prototipo pre-comercial para la detección de endotoxinas tanto en laboratorio como en ensayos de campo. Este prototipo incluye los módulos necesarios para llevar a cabo análisis de muestras de endotoxinas: el biosensor electroquímico de película delgada biofuncionalizado, una cámara microfluídica de ensayo y un potenciostatogalvanostato portátil. La plataforma, completamente integrada y portátil, permite la detección de muestras de endotoxinas de forma específica, lo que la convierte en una alternativa real a la técnicas existentes en el mercado.