Caracterización de las dnasas activadas en la estimulación y apoptosis de monocitos

Resum

La apoptosis es un proceso fisiológico de muerte celular que asegura el continuo recambio de las células en los tejidos en la embriogénesis y en el organismo adulto. Además se han descrito alteraciones en la apoptosis relacionadas con algunas enfermedades. Una característica importante de la apoptosis es la degradación oligonucleosomal del DNA genómico, mediada por la activación de DNsas. En este trabajo se ha detectado un aumento de actividad DNasa en el citosol, los granos de secreción y el núcleo de monocitos de pacientes con patología autoinmunes respecto a los de donantes sanos, cuya actividad aumenta in vitro en respuesta a un pépetido activador. La presencia del NMLA, un inhibidor de la iNOS, neutraliza la estimulación por el péptido. El posterior análisis de las actividades Dnasa mostró la presencia de varias Dnasas implicadas, por lo que se procedió al aislamiento y caracterización de estas enzimas en la línea celular humana U937. Para la detección y análisis de Dnasas, fue necesaria la utilización de ensayos complementarios de actividad, como la degradación de DNA en geles de agarosa, zimogramas y técnicas radiactivas, y la optimización de técnicas fluorescentes de alta sensiblidad, como la del picogreen o el ensayo continuo basado en el fenómeno de resonancia denominado FRET. Se ha demostrado la paricipación de la DFF40 y de otra DNasa de similares características tras las estimulación apoptótica de las céulas U937 con camptotecina y anticuerpo anti-Fas. La DFF40 se detectó por anticuerpos y no por actividad, mientras que la segunda sólo se puso de manifiesto por ensayos de actividad DNasa por falta de anticuerpos específicos. Se trata de una DNasa citosólica, neutra dependiente de magnesio, de unos 40 kDa que migra al núcleo en la apoptosis. En ausencia de estimulación también se detectaron diferentes isoformas de la DNasa II y actividades DNasa de tipo I dependientes calcio y magnesio.