Diseño molecular de ensayos pcr múltiple a tiempo real para el diagnóstico diferencial de la tuberculosis extrapulmonar y complicaciones focales de la brucelosis

Zusammenfassung

La tuberculosis y la brucelosis son enfermedades granulomatosas de curso crónico, que continúan persistiendo como importante causa de mortalidad y morbilidad en muchos países. Ciertas formas de tuberculosis extrapulmonar y complicaciones focales de la brucelosis son muy difíciles de diferenciar de forma clínica, radiológica e incluso histopatológica. Los métodos microbiológicos convencionales para ambas enfermedades presentan limitaciones, retrasos en el tiempo de identificación y demoras en el tratamiento antimicrobiano correcto. El objetivo de este estudio ha sido el desarrollo y validación de un ensayo PCR múltiple a tiempo real para la detección diagnóstica diferencial de formas extrapulmonares de la tuberculosis y complicaciones focales de la brucelosis. Para ello, se diseñaron tres parejas de cebadores específicos para el complejo Mycobacterium tuberculosis (cfp32, IS6110 y senx3-regx3) y tres parejas de cebadores específicos para el género Brucella (bcsp31, IS711 y omp2a). De los nueve ensayos múltiples desarrollados, el análisis de disociación permitió la detección simultánea y diferencial de ambos patógenos con tres combinaciones de cebadores (senx3-regx3 + bcsp31, senx3-regx3 + IS711 e IS6110 + IS711), con un límite de detección de 2-3 genomas con las combinaciones senx3-regx3 + bcsp31 y senx3-regx3 + IS711, y de 221-296 genomas con IS6110 + IS711. El contenido GC y el número de copias de las secuencias diana fueron los componentes que más influyeron en la eficiencia de los ensayos. De las tres combinaciones candidatas, sólo senx3-regx3 + IS711 fue 100% específica con todas las cepas incluidas en el estudio. El rendimiento diagnóstico de los ensayos múltiples fue evaluado en 91 muestras clínicas procedentes de 24 pacientes con tuberculosis extrapulmonar, 30 pacientes con complicaciones focales de la brucelosis y 36 pacientes control con diferentes enfermedades que inicialmente participaban en el diagnóstico diferencial. Para el total de muestras estudiadas, la sensibilidad, especificidad, VPP y VPN de los ensayos fue del 89,1%, 100%, 85,7% y 100% respectivamente, con una precisión del 93,4%. El ensayo basado en la coamplificación de senx3-regx3 e IS711 es más específico que los otros dos ensayos, y permite la detección rápida y diferencial del complejo Mycobacterium tuberculosis y el género Brucella en diferentes muestras clínicas, lo que le convierte en una herramienta muy útil para el diagnóstico diferencial entre tuberculosis extrapulmonar y complicaciones focales de la brucelosis.