Statistical analysis in finding of alternative splicing using splicing arrays

Resumo

Una característica común de muchos genes es que sufren de Splicing Alternativo (SA). Éste proceso permite que un mismo mRNA primario pueda generar diferentes transcritos. Alteraciones en el proceso de Splicing Alternativo se han relacionado con diferentes enfermedades, en el que se incluye el cáncer. El SA es una diana terapéutica de gran interés y hay una investigación activa para la búsqueda de nuevos fármacos diana. Las plataformas de análisis a nivel genómico son herramientas potentes que permiten entender el papel que juega el SA en diferentes patologías. La búsqueda de isoformas se puede llevar a cabo empleando tecnologías de microarrays (por medio de arrays de exones o de junctions) y de RNA-Seq. La implementación de algoritmos eficientes para cualquiera de las dos tecnologías supone un gran reto. Este trabajo está centrado en microarrays de exones y de junctions, porque, a pesar de sus limitaciones (los resultados se limitan a las probes incluidas en el microarray), esta tecnología es adecuada para diferentes aplicaciones. Además el análisis de microarrays, menos laboriosa que el de los datos de RNA-Seq. El primer objetivo de la tesis es el desarrollo de una pipeline para la anotación de arrays de Affymetrix. La anotación, contra el transcriptoma de interés (por ejemplo el de Ensembl), se puede hacer en un ordenador personal en un tiempo razonable (menos que 2 horas). Se ha tenido especial cuidado a la hora de trabajar coi las hibridizaciones cruzadas. Esta pipeline se ha aplicado para anotar cinco diferentes arrays de Affymetrix. Los resultados han mostrado que realizar una buena anotación es de vital importancia a la hora de analizar los microarrays. Algunas de las probes mapearon en más de 1000 posiciones diferentes del transcriptoma. Hay pocos algoritmos que hacen uso de la información redundante provista por las junction probes. El segundo objetivo de esta tesis ha sido el de desarrollar ExonPointer, un algoritmo que emplea los datos de las probes de exones y junctions para identificar cassettes en exones anotados ¿el tipo de splicing más común en mamíferos-. Como prueba de concepto, aplicamos el algoritmo para analizar casos de splicing diferencial en tres diferentes estudios. Uno de los estudios corresponde a datos de células A549 de adenocarcinoma de pulmón tras la de-regulación del SRSF1, un factor de splicing oncogénico. El segundo de los estudios se realizó en muestras de humano de dos subclases de cáncer de pulmón no microcítico i.e. adenocarcinoma y carcinoma escamoso de pulmón. En el tercer estudio buscamos casos de Splicing Alternativo en Glioblastoma multiforme (GBM). Los resultados de PCR mostraron que los cassettes predichos con nuestro algoritmo ExonPointer se validaban en un ratio del 60 al 100%. Estos resultados muestran que ExonPointer es una buena alternativa para la detección cassettes.