Detección y caracterización fenotípica y funcional de linfocitos t cd8+ antivirales

Resumen

Titulo: DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN FENOTIPICA Y FUNCIONAL DE LINFOCITOS T CD8+ ANTIVIRALES RESUMEN: La principal utilidad del estudio fenotípico del linfocito T por citometría de flujo es la detección de alteraciones para la identificación de células malignas. Sin embargo, por lo que respecta a la evaluación de la respuesta inmunitaria, su utilidad es escasa. Una de las razones por las que esta área se ha desarrollado poco es el hecho de que hasta ahora los estudios fenotípicos se realizaban en la población linfocitaria total, que es una mezcla heterogénea de clones linfocitarios con distintas especificidades antigénicas y en distintos estadios de diferenciación. En los últimos años se están desarrollando técnicas que identifican linfocitos específicos frente a antígenos concretos, lo cual abre un nuevo camino en el estudio de la respuesta inmunitaria. Sin embargo, la sensibilidad de este tipo de técnicas oscila entre 0,01 y 0,02%, lo que las incapacita para la detección directa ex vivo de clones linfocitarios muy minoritarios. De hecho, los estudios disponibles hasta el momento se centran fundamentalmente en linfocitos específicos de virus que generan una potente respuesta citotóxica y por tanto fácilmente detectable, como son CMV, EBV o HIV. Llama la atención que todos estos estudios analizan prácticamente las mismas moléculas - marcadores de diferenciación celular y moléculas implicadas en el tráfico linfocitario -, pero no se ocupan de buscar marcadores de actividad citotóxica. Con estos antecedentes nos planteamos dos objetivos en el presente trabajo: l. La puesta a punto de técnicas de alta Sensibilidad para la detección de clones específicos de antígeno presentes en muy baja frecuencia. Se eligió como modelo la identificación de linfocitos T específicos del virus de hepatitis B (VHB) en individuos sanos vacunados con Engerix. Para la identificación de linfocitos T CD8+ se utilizaron dos tipos de tetrámeros (o pentámeros): HbsAgl83-191 y HbsAg335-343, ambos presentados por hla-a*0201. Se consiguió poner a punto una técnica con una sensibilidad de 9x10-7. Para la identificación de linfocitos t CD4+ se utilizó la técnica de citoquiñas intracelulares, es decir, el análisis de linfocitos t CD4+ productores de iFNg en respuesta a la proteína de superficie de VHB. Se consiguió una sensibilidad de 4 x 10-6. Utilizando ambas técnicas se detectó una respuesta específica t CD4+ mínima en individuos sanos vacunados con Engerix. No se detectó respuesta T CD8+.2. La caracterización de linfocitos t antiviral es en distintas situaciones clínicas, con el objetivo de identificar moléculas de membrana que constituyeran marcadores de actividad citotóxica. Se analizó la población de linfocitos t CD8+ específicos de CMV, subdividida en subpoblaciones definidas por CD57 y CD28, en 29 donantes sanos hla-A*0201 CMV+ y 54 pacientes hla-A*0201 CMV+ trasplantados de órgano sólido en tratamiento inmunosupresor. Se incluyó un paciente que sufrió una reactivación por CMV. Se analizó la expresión de tres moléculas que algunos autores consideran marcadores de actividad citotóxica - CD85J, CD160 y CD244 -, y se correlacionó con la expresión de perforina y la producción de iFNg. Los resultados demuestran que ninguna de ellas puede considerarse marcador de actividad citotóxica: CD85J parece comportarse como una molécula inhibidora de la activación del TCR, expresándose en células citotóxicas para elevar su umbral de activación. CD160 y CD244 corresponden presumiblemente a moléculas coestimuí adoras que actuarían fundamentalmente en ausencia de CD28. Su máxima expresión no se produce en células con máxima actividad efectora, sino en células que acaban de perder la expresión de CD28.