Diseño produccion y evaluacion de un virus adenoasociado que expresa interferon alfa para el tratamiento de la hepatitis cronica b

Resumen

El interferón alfa (iNFalfa) es una citoquina clave en la defensa frente a infecciones virales debido a su acción antiviral directa y a sus propiedades inmunomoduladoras. La proteína recombinante se emplea como un fármaco para el tratamiento de diversas enfermedades entre las que se encuentra la infección crónica por el virus de la hepatitis b (vhb). Mas de 400 millones de personas están infectados crónicamente por este virus, aumentando en ellas el riesgo de desarrollar cirrosis y cáncer de hígado. La eficacia del tratamiento de esta infección con iNFalfa es del 33% y provoca importantes efectos adversos. Para aumentar la eficacia y minimizar los efectos adversos, se ha estudiado en este trabajo la posibilidad de producir el iNFalfa en el propio organismo. Para ello se ha empleado un virus adenoasociado recombinante (vaa) que expresa el interferón alfa cinco de la marmota (miNFalfaS). Se ha evaluado la liberación de iNFalfa tras la inyección del vaa en el hígado y tras la inyección en el músculo. El modelo animal utilizado para evaluar la liberación de interferón, la eficacia antiviral y la seguridad de este tratamiento ha sido la marmota infectada crónicamente por el virus de la hepatitis de la marmota (VHM) ya que es el modelo animal que mejor reproduce la infección crónica del VHB en humanos. Se comenzó clonando y caracterizando la familia de los interferones alfa de la marmota, encontrándose que está formada por más de 16 secuencias. De entre ellas, se escogió el miNFalfa5 por combinar gran actividad biológica y por ser el más expresado basalmente en el hígado. A continuación, se produjeron dos virus adenoasociados recombinantes: uno con el gen de la luciferasa (vaa-luc) y otro con el gen del mlNFalfa5 (vaa-INF). Las producciones se hicieron mediante transfección de células 293T usando como vector no viral la polietilenimina y los virus se purificaron mediante cromatografía de afinidad en columnas de heparina. Se compararon tres vías de administración de los vaa dirigidas al hígado: la intravenosa, la intraportal y la intrahepática. Para ello se inyectaron grupos de ratones Balb/C con el vaa-luc y se estudió la expresión a lo largo del tiempo. Tras la inyección intravenosa, se infecta el hígado de forma homogénea pero se observan grandes diferencias según el sexo. La inyección intrahepática directa permite mayor expresión que la inyección intravenosa, encontrándose pocas diferencias entre sexos, sin embargo, la expresión se localiza fundamentalmente en el lóbulo inyectado. Por ultimo, la inyección intraportal combina altos niveles, gran distribución en el hígado y pocas diferencias entre sexos siendo la vía de administración elegida para la liberación hepática de iNFalfa mediante el vaa-INF. Tras la inyección intraportal del vaa-Luc a marmotas, la luciferasa se expresó en el hígado durante al menos seis meses. No se observó ninguna reacción adversa debido a la inyección del vaa-Luc en marmotas infectadas con el VHM, sugiriendo que la administración de los vaa en pacientes con VHB es segura. La inyección intramuscular del vaa-INF en marmotas crónicas provocó una expresión sostenida pero fluctuante de iNFalfa que se asoció a un efecto terapéutico tardío en tres de cinco marmotas. Por el contrario, la expresión de iNFalfa mediante este virus tras inyección intraportal es eliminada en la mayoría de los animales a los dos meses de la inyección obteniéndose una eficacia antiviral limitada. Los resultados obtenidos permiten diseñar nuevos pasos para la aplicación de esta estrategia en humanos. Por una parte, es necesario incluir promotores inducibles que permitan suspender o regular la producción de iNFalfa en caso de que se presenten efectos adversos graves. Por otra parte, el uso de otros serotipos de vaa permitirá aumentar los niveles de iNFalfa obtenidos por la vía intramuscular o mantener niveles elevados de iNFalfa en el hígado mediante inyecciones sucesivas de distintos serotipos de vaa por vía intraportal.