Propagación del virus del bosque de semliki en ausencia de cápsidadesarrollo de nuevas estrategias de movilización de vectores para terapia génica

Resum

El virus del Bosque de Semliki (SFV) es un Alfavirus, son virus con envuelta y genoma RNA monocatenario de polaridad positiva. Los vectores de SFV se basan en un RNA viral autorreplicativo que contiene la secuencia de la replicasa, y las secuencias de los genes estructurales virales han sido sustituidas por un gen heterólogo. Para empaquetar estos vectores en partículas virales se cotransfectan el RNA vector junto con RNAs Helper que aportan las proteínas estructurales del virus en trans. Las partículas virales generadas contienen sólo el RNA vector por lo que son capaces de infectar células pero no se propagan, ya que carecen de los genes que aportan las proteínas estructurales. En trabajos previos realizados en el laboratorio un vector de SFV que expresa la interleuquina 12 (SFV-enh-IL-12), mostró un potente efecto antitumoral en diferentes modelos de tumores implantados en roedores. La capacidad antitumoral de dicho vector en tumores espontáneos de mayor tamaño fue más limitada y de ahí el interés en mejorar el efecto antitumoral de estos vectores mediante su propagación dentro del tumor. Una estrategia para propagar los vectores SFV desarrollada en esta tesis está basada en la coinfección de células con vectores no propagativos y virus SFV silvestre (SFVwt), el cual aportaría las proteínas estructurales en trans necesarias para volver a empaquetar el RNA vector. Se ha observado que vectores no propagativos de SFV (SFV-LacZ) pueden ser movilizados mediante la coinfección de células con SFVwt. La coadministración de tumores MC38 con el vector de SFV que expresa luciferasa y SFVwt aumentó la expresión del gen marcador en los tumores, sugiriendo que se había producido la movilización del vector in vivo. Al estudiar el efecto antitumoral del vector SFV-enh-IL-12 en combinación con SFVwt se observó un aumento significativo del efecto antitumoral con respecto a animales tratados con el vector SFV-enh-IL-12 sólo. Otra estrategia de movilización de SFV está basada en la observación realizada en nuestro laboratorio de que un virus SFVwt desprovisto de cápsida es capaz de propagarse. Dada la relevancia virológica de esta observación se caracterizó este fenómeno. Previamente se había descrito que para la producción de partículas virales de SFV es necesaria la expresión simultánea de las proteínas de la envuelta y de la cápsida en la misma célula. Sin embargo, en esta tesis se demuestra que SFV puede propagarse en ausencia completa de cápsida. Esta propagación es más efectiva cuando el vector expresa mayores niveles de las proteínas de la envuelta. Esta capacidad de propagación se produce en diferentes tipos celulares y es común a otros miembros del grupo alfavirus (Sindbis). La propagación no está mediada por fusión de membranas plasmáticas y es dependiente de la expresión de las proteínas de la envuelta en la membrana de las células infectadas. El mecanismo de propagación está mediado por la liberación de microvesículas infecciosas que contienen las proteínas de la envuelta y RNA viral. El RNA que incorporan las microvesículas parece ser específico y requiere que éste codifique el gen de la replicasa. La incorporación del RNA viral en microvesículas parece estar mediada por una interacción con la cola citoplasmática de la proteína de la envuelta del virus E2. Las células infectadas con los virus desprovistos de cápsida también inducen la formación de numerosos filopodios, que podrían estar implicados en el proceso de propagación ya sea porque constituyan un modo de aumentar la superficie de membrana plasmática o porque sirvan para acercar las microvesículas a las células vecinas. Asimismo se ha demostrado q es posible modificar el vector desprovisto de cápsida para expresar un gen heterólogo a partir de un segundo promotor subgenómico, sin que afecte a su capacidad de propagación. El efecto terapeútico de un virus desprovisto de cápsida que expresa IL-12 fue ligeramente mayor que el de un vector no propagativo a dosis bajas (106)