Nuevo protocolo de producción de adenovirus de alta capacidad basado en un adenovirus helper auto-inactivable

Resumen

Los métodos estándar para la producción de vectores adenovirales de alta capacidad (HC-Ad) están basados en la co-infección con adenovirus helper. Para evitar encapsidación del virus helper, su señal de empaquetamiento (Ψ) está flanqueada por secuencias de reconocimiento de recombinasas expresadas por las células empaquetadoras. Sin embargo, frecuentemente se observa una acumulación de virus helper y un bajo rendimiento en la producción de HC-Ad. Esto es debido, en parte, a la expresión insuficiente de la recombinasa por parte de las células empaquetadoras. En el presente trabajo se describe un nuevo virus helper (AdTetCre) donde su secuencia Ψ está flanqueada por sitios loxP que pueden ser escindidos por una recombinasa quimérica llamada MerCreMer codificada por el genoma del propio virus. La modulación eficiente de la escisión se logra con un control simultáneo de la expresión MerCreMer utilizando un sistema inducible tet-on y su translocación al núcleo por 4-hidroxitamoxifeno. La encapsidación del virus AdTetCre se inhibe mediante doxiciclina y 4-hidroxitamoxifeno. Para la producción del HC-Ad se utilizan células 293Cre4 y el virus AdTetCre donde se observa que existe una cooperación entre la recombinasa celular y la codificada por el virus minimizando la contaminación con virus helper. Este nuevo método es altamente reproducible y permite la producción rutinaria en el laboratorio de diferentes HC-Ad a mediana escala con células adherentes, obteniendo títulos mayores de 1010 unidades infecciosas y menos del 0,1% de contaminación de virus helper. La contaminación residual de virus helper AdTetCre carece de secuencia Ψ y están altamente atenuados. Como conclusión, el virus helper auto-inactivable AdTetCre es una herramienta prometedora para la producción del HC-Ad.