La transcriptasa inversa del hiv-1analisis de la dimerizacion y de la inhibicion por terminadores de cadena

Zusammenfassung

Se ha purificado mediante cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados el polipéptido de 66 kDa, que forma parte de la transcriptasa inversa del HIV-1. El análisis de la muestra mediante cromatografía de filtración en gel indica que la proteína se encuentra en equilibrio entre la forma monomérica (p66) y la dimérica (p66/p66). La actividad DNA polimerasa RNA dependiente reside exclusivamente en la forma homodimérica de la enzima, aunque aproximadamente la mitad de los dímeros son inactivos. La dimerización de la subunidad p66 se produce en dos etapas. En la primera etapa las subunidades se asocian para formar un homodímero inactivo. Las sales anticaotrópicas y el aumento de temperatura favorecen la dimerización de la subunidad p66, aumentando tanto la velocidad a la que se alcanza el equilibrio como la estabilidad del homodímero. Se han estudiado los factores que afectan a la inhibición ejercida por los terminadores de cadena en los ensayos enzimáticos utilizando el AZT-TP como modelo. La incorporación de un solo terminador de cadena en cualquier etapa durante la síntesis provocaría la terminación de la polimerización e impediría que se completara la síntesis viral. Hemos analizado la combinación de terminadores de cadena utilizando un patrón-cebador en condiciones en que únicamente existe un solo sitio de terminación para cada análogo. En esas condiciones, la combinación de AZT-TP y ddCTP, dos inhibidores que compiten con distintos sustratos, inhiben sinérgicamente la actividad enzimática. Por el contrario la combinación de AZT-TP con ddTTP, dos inhibidores competitivos mutuamente excluyentes, no muestran sinergia cuando se prueban sobre la RT purificada. Si se utiliza un patrón-cebador que posee varios sitios potenciales de terminación para AZT-TP y ddCTP, la sinergia entre ambos se pierde. Estos resultados son coherentes con el mecanismo de acción de los terminadores de cad