Purificacion de complejos plasmina-antiplasmina y desarrollo de un nuevo metodo inmunoenzimatico para su deteccion en plasma

Resum

La presencia de complejos plasmina-alfa2-antiplasmina (pap) en plasma es considerada un buen marcador de activacion del sistema fibrinolitico in vivo. Hemos desarrollado un nuevo metodo de purificacion de pap in vitro añadiendo uroquinasa a plasma fresco. La mezcla fue sometida a lisina-sefarosa tras lo cual se eluyo con acido epsilon-aminocaproico. Tras filtracion en gel en sephadex g-200 sf el material fue caracterizado por sds-page y western-blotting, mostrando una banda unica de pm 140000 reconocida tanto por anticuerpos anti-plasminogeno como por anticuerpos anti-alfa2-antiplasmina. La cantidad de complejo puro estaba en el rango de 1 mg por 100 ml de plasma. Con este material se inmunizaron ratones para obtener anticuerpos monoclonales especificos. Un nuevo inmunoensayo tipo elisa para la cuantificacion de pap en plasma se puso a punto usando dos anticuerpos monoclonales dirigidos contra diferentes partes del complejo. El ensayo se calibro con concentraciones conocidas de pap purificado, entre 0,75 y 200 ng/ml. El limite inferior de sensibilidad del metodo fue de 1,5 ng/ml. Se obtuvo un rango de referencia de 400 a 700 ng/ml (promedio 545+/-98 ng/ml) para la concentracion de pap en muestras de plasma de 30 donantes sanos. En muestras de pacientes septicos o cirroticos los valores fueron significativamente superiores (1674 +- 758 ng/ml y 1444 +- 1253 ng/ml respectivamente). En pacientes sometidos a terapia trombolitica las concentraciones de pap registradas fueron de 20000 ng/ml o superiores. El metodo elisa descrito es valido para la deteccion especifica de pap en plasma humano y puede emplearse para el estudio de la activacion in vivo del sistema fibrinolitico.