Cancerous and non-cancerous lung extracellular matrixFrom a microstructure-mechanical property study to the development of a 3D platform to unravel cell-ECM interactions

Resumen

El cáncer de pulmón es la segunda causa más común de cáncer en mujeres y hombres, alrededor del 13% de todos los nuevos cánceres diagnosticados. Es la causa primaria de muerte por cáncer en mujeres y hombres. Causa más muertes al año que el cáncer de colon, mama y próstata combinados. Alrededor de 228,150 nuevos casos se esperan para el año 2020 que causaran un total de 142,670 muertes en los Estados Unidos tal y como anuncia La Sociedad Americana del Cáncer. Las propiedades mecánicas de la Matriz Extracelular (ECM) de muchos tejidos, y específicamente del pulmón, han demostrado afectar las funciones tanto celular como a nivel tisular. De hecho, se sabe que existe una reciprocidad dinámica entre las células y la mecánica de la ECM, y esta comunicación se ve afectada durante estados patológicos. El objetivo de esta tesis es caracterizar el comportamiento mecánico a escala local de la ECM de pulmón y correlacionarlo con su microestructura. Para realizar este estudio, se ha montado una cabeza de un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) sobre la base de un Microscopio de epifluorescencia, de tal forma que se pueda obtener información de la microestructura de las principales proteínas fibrilares de la ECM (Colágeno I, Colágeno III y Elastina) y de las propiedades mecánicas de la ECM de forma simultánea en la misma posición. Se obtuvieron 7 muestras de paciente de cáncer de pulmón, se hicieron cortes de 7 µm, se identificaron regiones cancerosas y no cancerosas en cada muestra, se descelularizaron y se realizaron tinciones de inmunofluorescencia siguiendo un protocolo de anticuerpo primario/secundario para las principales proteínas fibrilares de la ECM: colágeno I, colágeno III y elastina. Después, se realizaron 400 indentaciones de 500 nm de profundidad en un área de 100 µm *100 µm mientras se obtenían mapas de proteínas de la zona indentada. Considerando las muestras de los 7 pacientes, se midió un módulo elástico efectivo medio para las regiones no cancerosas de la ECM de pulmón de 6.33 ±1.13 kPa, mientras que el módulo elástico medio en las regiones cancerosas fue de 15.65±4.04 kPa. Es decir, la rigidez es 2,5 veces superior en las zonas cancerosas. Para todas las muestras, el módulo de Young mostró una distribución Gaussiana de rigideces. Cuando todos los ensayos de indentación fueron graficados de forma conjunta para una misma muestra, se obtuvo una distribución bimodal para todos los pacientes. El primer pico de la distribución correspondía a la ECM no cancerosa y el segundo pico de la distribución a la ECM cancerosa. Los valores medios obtenidos de la distribución bimodal sobreestimaban los valores medios medidos de la ECM cancerosa y no cancerosa. Después se calculó la correlación entre las medidas de fracción volumétrica de proteína obtenidas en las muestras y el módulo elástico medido. La fracción volumétrica se calculó de dos maneras, una de ellas relativa a la intensidad máxima de todas las muestras y la otra relativa a la intensidad máxima de cada muestra. Ambas mostraron un incremento en la fracción volumétrica del colágeno I de 1.7 y .1.5 veces mayor respectivamente para la ECM cancerosa frente a la no cancerosa. Ambas mostraron una correlación positiva entre la fracción volumétrica obtenida y el módulo elástico medido para todos los puntos de cada muestra. Entre muestras, la segunda mostró una correlación entre la fracción volumétrica media y el módulo elástico medio de cada muestra con R2=0.60. Se implementó el modelo de Eshelby para predecir el comportamiento mecánico de la matriz extracelular del pulmón canceroso y sano. El modelo puede estimar el módulo elástico de una matriz con inclusiones elipsoidales, que representarían a las fibras de colágeno dentro de la ECM. Se consideraron dos posibles distribuciones para la orientación de las fibras. La primera asume que las fibras de colágeno I están orientadas en 3D. Utilizando un módulo elástico para el colágeno I de 100 MPa, dentro del rango reportado en literatura, los valores del módulo elástico de la ECM se sobreestimaban por dos órdenes de magnitud. Se calculó un nuevo valor del módulo elástico de las fibras de colágeno I utilizando el modelo y las medidas obtenidas de los 10 puntos con mayor fracción volumétrica de colágeno I en todas las muestras. Este cálculo se hizo de manera separada para las muestras no cancerosas y cancerosas obteniendo un módulo elástico para las fibras de colágeno I de 390 kPa para las muestras no cancerosas y 1050 kPa para las muestras cancerosas, muy por debajo de los valores reportados en literatura. El modelo fue capaz de predecir el módulo elástico de la ECM no cancerosa y cancerosa con un error medio del 25.08% y 32.74% respectivamente con un ajuste a una regresión lineal de R2=0.6155 frente a los valores medidos en AFM. La segunda aproximación supone que las fibras de colágeno I están orientadas en el plano 2D. En este caso, se asume que el módulo elástico de las fibras de colágeno es de 100 MPa, dentro del rango reportado en literatura. El módulo elástico de la matriz fue ajustado para minimizar el error absoluto entre el valor medido y el módulo elástico predicho de la ECM. Esto se hizo de manera separada para las muestras cancerosas y no cancerosas, sobre todo porque el efecto del crosslinking no se midió en este trabajo. Los mejores resultados se obtuvieron para Ematrix = 0.12 kPa para las muestras cancerosas y Ematrix = 0.05 kPa para las no cancerosas y calculando la fracción volumétrica del colágeno I usando como referencia el máximo de intensidad medido en cada muestra. El modelo fue capaz de predecir el módulo elástico de la ECM con un error de 14.48% para las muestras no cancerosas y un error de 11.15% para las muestras cancerosas con un ajuste a una regresión lineal de R2=0.94 frente a los valores medidos en AFM. Finalmente, se desarrolló una plataforma para el estudio de las interacciones célula-ECM en tres dimensiones basada en hidrogeles de Ácido Hialurónico. Se sintetizó Ácido hialurónico con grupos metacrilato que permitían el crosslinking mediante dithiothreithiol, esto permitía a los hidrogeles alcanzar rigideces en un rango entre 0,2 y 19 kPa, rango que incluye las medias de los módulos de Young efectivos de la matriz cancerosa y no cancerosa. Resumidamente, la gelificación de los hidrogeles se realizaba con las células embebidas en ellos mediante el uso de un motor rotatorio que mantenía las células suspendidas en el espacio tridimensional en todo momento, a 37ºC dentro de una incubadora. El protocolo no sólo permitía una distribución homogénea de las células en los hidrogeles, sino que además permite evitar los efectos de durotaxis que puedan ser provocados por la plataforma. Se realizaron ensayos de migración en 3D dentro de la plataforma para las líneas celulares A549 y H1299 a diferentes niveles de rigidez, las cuales mostraron para la línea H1299 una mayor capacidad invasiva y migratoria.