Localización subcelular y regulación post-traduccional del transportador hepático de adenosina Rcnt2

Resumen

Las funciones del hígado son importantes debido a su localización estratégica, entre el sistema digestivo y el resto del cuerpo (la circulación sistémica). La generación de los anticuerpos contra los transportadores de nucleósidos sodio-dependientes rCNT1 (pirimidina preferente) y rCNT2 (purina preferente) permitieron identificar la presencia de estos dos transportadores en hígado. El primer objetivo de esta tesis es establecer la localización y la distribución subcelular de rCNT1 y rCNT2 en hepatocitos de rata. Los hepatocitos representan un 60-80% de la masa celular total del hígado; son células altamente polarizadas y se caracterizan por tener una membrana plasmática diferenciada en tres dominios funcionales diferentes: la membrana basal la apical y la lateral. Por estas características y por ser muy activos metabolitamente, las células hepáticas son un buen modelo para el estudio de las rutas endocíticas. Examinamos la localización subcelular de tres maneras distintas. Primero, detectamos por técnicas de transporte y por Western blot la expresión de CNT1 y CNT2 en fracciones enriquecidas en membranas plasmáticas canaliculares y basolaterales. Segundo, determinamos la cantidad proteica y la distribución de CNT1 y CNT2 en fracciones purificadas de endosomas de hígado de rata, mediante utilización de anticuerpos contra estos transportadores. Tercio, por técnicas de microscopía electrónica. Estos estudios indican que el transportador de nucleosidos CNT1 llega en la membrana canalicular, en la cual el transportador es biológicamente activo, por una ruta indirecta a través de la membrana basolateral. Su inserción se realiza cerca de microdominios especializados enriquecidos en caveolas. CNT2 se detecta de manera casi exclusiva en preparaciones enriquecidas en membranas plasmáticas basolaterales en las cuales el transportador es activo. Estos estudios nos indican que los dos transportadores CNT1 y CNT2 tienen una ubicación diferente en células hepáticas, por lo que estos dos transportadores parecen estar diferencialmente regulados. En la segunda parte de esta tesis examinamos las interacciones entre el transportador concentrativo de adenosina CNT2 y los receptores purinérgicos. Las células hepáticas previamente tratadas, a corto plazo, con el agonista del receptor A1, (-)-N(6)-(2-phenylisopropyl)adenosine (RPIA) produce el incremento de la actividad de transporte de CNT2. Este efecto se inhibe en presencia de inhibidores de los canales KATP y se mimetiza en presencia de activadores de dichos canales. Estos estudios revelan que en células hepáticas, la actividad de transporte de CNT2 se regula por activación de los receptores A1, vía los canales KATP. Se ha demostrado también que la inducción de la actividad de transporte de CNT2 mediante la apertura de los canales KATP es dependiente de la activación de la PKC. Por ultimo, observamos que la glicemia y el metabolismo de la glucosa podrían afectar la regulación purinérgica de CNT2 ya que la inducción de la actividad de CNT2 mediante el receptor A1 puede ser modulada con la concentración en glucosa del medio. Estudiamos en la tercera parte de esta tesis el papel del óxido nítrico y de la PKC en la activación post-traduccional de CNT2 en células hepáticas. Medimos la actividad de transporte de CNT2 en células Fao y en cultivo primario de hepatocitos después de incubar las células con diferentes activadores e inhibidores de la óxido nítrico sintasa (NOS). El resultado fue que la inhibición de la NOS provoca un aumento de la actividad de transporte de CNT2 de un 60%. Mediante inhibidores de la actividad de la PKC y bloqueadores de los canales KATP, determinamos que la disminución de la concentración intracelular de óxido nítrico contribuye en la activación, a corto plazo, del transportador CNT2 mediante la activación, independientemente de la PKC, de los canales KATP. "RESUMEN INGLÉS: The first part of this these study of the subcellular localization and trafficking of CNT1 and CNT2 in rat hepatocytes. These studies indicated that the Na+-dependent nucleoside transporter CNT1 is present in a caveolin-enriched plasma membrane fraction (CEF), in transcytotic endosomes, and in canalicular membranes isolated from quiescent rat liver in which the transporter appears to be biologically active. Plasma membrane preparations enriched in basolateral markers showed Na+-dependent nucleoside transport activity that is mostly, if not exclusively, accounted for by CNT2, a transporter protein that it is not detected in CEF nor in the endosomal fractions. The two CNT transporters are spatially segregated and that this is due to their localization being regulated by distinct trafficking pathways in hepatocytes. CNT1 as being the first transporter that follows the transcytotic pathway for insertion into the apical side of liver parenchymal cells. The second part is focused on interactions between CNT proteins and purinergic receptors. These studies reveal a novel mechanism of regulation of the high affinity concentrative adenosine transporter, CNT2, via activation of adenosine A1 receptor in liver. This regulation is mediated by the activation of ATP-sensitive K(+) (K(ATP)) channels. The transient increase in CNT2-mediated transport activity triggered by (-)-N(6)-(2-phenylisopropyl)adenosine is fully inhibited by K(ATP)-channel blockers and mimicked by a K(ATP) channel opener. The extent of the purinergic modulation of CNT2 can be modulated by the glucose concentration, a finding that indicates that glycemia and glucose metabolism may affect this cross-regulation among A(1)R, CNT2, and K(ATP) channels. The third part involves a study of the effects of endogenous nitric oxide (NO) synthesis on the concentrative adenosine transporter, CNT2. Inhibition of endogenous NO synthesis (using either L-NAME and L-NMMA) in hepatoma FAO cells and in primary cultures of rat hepatocytes increases the functional activity of CNT2. This effect can be reversed by the addition of NO donors. Unlike the purinergic-mediated response, the activation triggered by NO inhibitors is poorly dependent on extracellular glucose, although interestingly, it can still be inhibited by the addition of K(ATP) channels blocker, glibenclamide."