Nuevas proteínas de unión a rnaEfecto en la traducción dependiente de ires

Resum

La síntesis de proteínas es un proceso fuertemente regulado. Los picornavirus han desarrollado estrategias para sortear la inhibición de la traducción que ocurre durante la infección. Una de estas estrategias reside en el elemento de entrada interna del ribosoma (IRES), que recluta la maquinaria de traducción sobre el codón de iniciación. Los elementos IRES son regiones de RNA modulares. El IRES del virus de la fiebre aftosa (FMDV) contiene 5 dominios, responsables de la interacción en trans con proteínas de unión a RNA (RBPs) y factores de iniciación (eIFs), entre los que se encuentran PTB, PCBP2, Ebp1 o Gemin5. Gemin5 es una RBP citosólica implicada en la síntesis de la maquinaria de splicing. Es la proteína responsable de reconocer los RNAs pequeños nucleares (snRNAs). Gemin5 interacciona con resinas de m7GTP, con elF4E, y con el IRES del virus de la hepatitis C (HCV) y el IRES de FMDV. La asociación con el IRES tiene lugar a través de una región distinta a la que reconoce los snRNAs, además, reprime la actividad IRES y se proteoliza durante la infección por FMDV. Gemin5 posee en su región C-terminal un sitio de unión a RNA bipartito, denominado RBS1 y RBS2. La transfección de fragmentos de Gemin5 en células silenciadas reveló que el dominio RBS2 es el responsable de reprimir la actividad IRES. El dominio 3 del IRES adopta una estructura cruciforme con varios subdominios, que determinan su estructura tridimensional, además se han descrito pocas proteínas que reconozcan este dominio. Mediante RNAs quimera que contienen aptámeros de estreptavidina hemos purificado proteínas asociadas a los subdominios del dominio 3 que contienen motivos esenciales para su actividad. La identificación de las proteínas purificadas mediante espectrometría de masas y su posterior validación mediante ensayos de interacción RNA-proteína, reveló que el dominio 3 interacciona con numerosas proteínas, como SYNCRIP, Celf1, NONO, Caprin1, RPS25 o Rack1, además de proteínas implicadas en el transporte celular, como ARF5 o Rab1b. El análisis de las proteínas diferencialmente unidas al IRES en el contexto de un RNA funcional mediante marcaje isotópico con aminoácidos pesados en células en cultivo (SILAC) indicó que el IRES tiene mayor afinidad por el ribosoma que un mRNA que no lo contiene. Además, varias de las proteínas identificadas coinciden con las observadas en el dominio 3, entre otras UPF1, una proteína implicada en el control de calidad del mRNA. UPF1 es una RBP promiscua, cuyo efecto sobre la traducción mediada por IRES podría basarse en la estabilidad del RNA. Los datos obtenidos en esta Tesis doctoral describen las regiones de Gemin5 implicadas en la interacción con el IRES y en la regulación de su actividad. Además, sugieren que el IRES puede estar implicado en otras etapas del ciclo viral, como el transporte del genoma viral al retículo para su traducción o a los orgánulos de replicación para su encapsidación.