Implementation and development of methods of labeling for the analysis of rna and dna based on microarray technology

Resumen

A mediados de los años 90 científicos entre ellos Stephen Fodor, y Michael Pirrung desarrollaron una revolucionaria tecnología para la determinación y cuantificación de ADN en una muestra. Esta tecnología desembocaría posteriormente en la primera plataforma de microarrays de ADN, denominada entonces GeneChip de Affymetrix. El desarrollo de la tecnología de microarrays de DNA, también llamados chips o microchips de DNA permite fijar covalentemente a un soporte sólido (vidrio, nitrocelulosa, nylon etc.) desde centenares hasta decenas de miles de sondas moleculares (fragmentos de DNA, proteínas, etc), en un espacio muy reducido. La principal ventaja de esta novedosa tecnología frente a los métodos tradicionales (Northern, Southern, etc) reside en la alta densidad de integración (cantidad) de material biológico que se consigue inmovilizar, es decir la posibilidad de analizar simultáneamente miles de genes. Con el avance de la técnica de inmovilización de muestras, se han desarrollado diversos tipos de microarrays: cadenas de oligonucleótidos, cDNA, proteínas y tejidos. Esto supone un gran avance tanto en escalado como en sensibilidad de detección, ya que los volúmenes de trabajo son muy pequeños, lo que supone a su vez mayores concentraciones de reactivos y cinéticas de hibridación más rápidas. La primera aplicación de los microarrays de ADN fue el análisis genético, pero en los últimos años su aplicabilidad ha ido en aumento, ampliando el abanico de ítems a interrogar tales como el análisis de mutaciones y detección de polimorfismos (SNP), identificación de copias génicas en un genoma (aCGH), análisis de alternative splicing , análisis del patrón de metilación de islas CpG (MSO), secuenciación, análisis de interacciones de proteínas con el DNA in vivo (ChIP-on-chip), estudio de los microARNs y su función en la regulación de genes, etc. Debido a la necesidad de manejo de gran cantidad de datos tanto de bases de datos con información genómica para el diseño de sondas (probes), como de los datos resultantes de la experimental del microarray, requiere el uso de potentes herramientas informáticas para ello. Objetivos El objetivo de esta tesis es aportar métodos de marcaje para distintas aplicaciones de la tecnología de microarrays. Para cada aplicación se ha desarrollado e implementado un proceso de marcaje específico y un diseño de oligonucleótidos que componen el microarray también específico, de manera que diseño de microarray y metodología de marcaje están estrechamente ligados. Todos los procedimientos experimentales de esta tesis atienden a un marcaje global del conjunto de la muestra. Las cuatro capítulos desarrollados en este trabajo se enfocan en : el estudio de cambios de expresión génica (Gene Expression), estudio de cambio de presencia de isoformas (Alternative Splicing), el estudio de cambios de dosis génicas (aCGH) y por último el estudio de cambios en el patrón de metilación de islas CpG (MSO) entre dos muestras a comparar. Para el diseño de microarrays, evaluación y análisis de datos también se recoge en este trabajo una descripción e interpretación de softwares informáticos, bien desarrollados en la empresa Oryzon Genomics o bien comerciales.